蔗糖—果糖基转移酶SST基因转入甜菜产生果聚糖的研究

发布时间：2020-11-18 06:24

　　 目的:果聚糖可用于预防并调节多种人类的疾病,并且对人体的毒副作用完全不存在,被认定是营养型的保健食品,已被许多国家批准并广泛的用在食品、化装品、饲料等。另外,果聚糖作为一种重要的渗透调节物质,与植物的抗逆性密切相关。因此,本研究拟通过导入外源果糖基转移酶基因来提高甜菜中果聚糖含量,获得高产甜菜株系,为利用高产植物作为生物反应器廉价生产功能性多糖奠定基础。方法:将洋葱(Allium cepa)的蔗糖-果糖基转移酶基因SST(sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase,1-SST)与甜菜根部特异性启动子MLL重组,以p BI121为起始载体,构建p BI121-MLL-SST,通过农杆菌介导法转化甜菜(Beta.vulgaris)品种,STFD4,利用PCR鉴定转化植株,并用RT-PCR技术检测SST基因的表达,分别对转基因甜菜株系和野生型甜菜的叶片相对含水量、MDA含量、相对电导率、PSII相对量子产率、和各糖类指标进行测定。结果:(1)本研究成功克隆并构建成植物表达载体p BI121-MLL-SST。经过农杆菌介导的方法转化进入甜菜,通过PCR与RT-PCR鉴定,获得转基因甜菜。(2)建立并优化了甜菜叶柄的再生体系。结果显示:最佳灭菌方式是将甜菜种子破除种壳后,种子先用10%H2O2处理1min,再用0.1%升汞灭菌10 min;最适宜的叶柄分化数的培养基是MS+6-BA1.0 mg·m L-1+NAA 0.2 mg·m L-1;从叶柄诱导的不定芽获取新的叶柄再诱导;最佳生根培养基是1/2MS+NAA 1.0 mg·m L-1+IBA 0.2 mg·m L-1,生根率达到95%以上;将生根组培苗移栽,成活率高达96%。(3)利用干旱胁迫处理进行抗旱性分析,结果表明:与对照相比,转SST植株叶片萎蔫较迟且程度较轻;其叶片相对含水量和PSII相对量子产率的降低幅度、相对电导率和丙二醛含量的升高幅度均低于对照甜菜植株。说明在干旱条件下,与对照之间相比,转p BI121-MLL-SST基因的各株系更能减少植物在水中的流失,更能有效的提高活细胞中的抗氧化物酶的活性,使转p BI121-MLL-SST基因甜菜的株系获得更高的抗旱性;所以在根特异性表达的启动子MLL的驱动下,转化SST基因的甜菜株系的抗旱性得到进一步的提升。(4)测定块根中碳水化合物浓度的变化,结果表明:与对照相比,转基因甜菜株系中碳水化合物的浓度发生了变化,其中蔗果三糖、果糖、葡萄糖浓度/mg·m L-1均高于野生型甜菜,而蔗糖浓度/mg·m L-1均低于野生型甜菜。并且果聚糖浓度的提高率在28.57%~74.34%之间。结论:利用基因工程的手段可有效地提高甜菜中低聚果糖的浓度,获得高产甜菜植株,这为开辟工业上以甜菜作为生物反应器生产低聚果糖奠定了基础。
【学位单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S566.3;Q943.2
【部分图文】：

分离并纯化出果糖基转移酶。例如：1-SST、1-FFT、6-SFT以及6G-FFT，已提出另外一种比较完整的高等植物中果聚糖不同类型的合成代谢模型（图1-1）.该模型认为：蔗糖通过1-SST作用生成蔗果三糖，在此基础上1-FFT延伸碳链生成菊糖型果聚糖。6-SFT因其特性是多种催化，所以可参与到多种反应中。6G-FFT作用于1-蔗果三糖产生新蔗果三糖。使其具有特异性反应的功能。图1-1 高等植物中生物合成果聚糖模型[46]Fig.1-1fructan model of Biosynthesis in higher plants注: 蔗糖作为合成的前体, 经不同的果糖基转移酶协同作用合成了不同结构的果聚糖。2.3 果聚糖的分类在微生物中，果聚糖的单体之间主要以β-2，6-键相互连接。在细菌中，是以β-2，1-键相互连接,并且分子量极大。在植物中，果聚糖多样化类型更加突出。目前，高等植物中发现的果聚糖类型有5种

66型的分布较少。它主要以β-2,6-键与1个或多个的果糖连接而形成(图1-2B)。(3)线型菊糖型果聚糖新生系列(linearinulinneoseries)：主要为百合科的植物特有，如洋葱、天门冬等。它是果糖基以线性β-2，1-键与蔗糖上葡萄糖分子中的两端Cl和C6位连接而形成。此果聚糖属于新蔗果三糖(图1-2C)。混合型果聚糖(mixedlevan)：主要为禾本科植物特有，如小麦、大麦等。它是以β(2-l)和β(2-6)键与1个或多个的果糖基连接而组成。混合型果聚糖中最小的分子为蔗果四糖(bifureose)(图1-2D)。(5)梯牧草糖型果聚糖新生系列(levanneoseries)：它只为少数植物所有,如燕麦。它的基本单位为新蔗果三糖。它是以β(2-6)键与果糖基单元连接而形成。(图2E)。2.4 果聚糖的分子生物学研究进展果聚糖是由蔗糖与一个或多个果糖基相连接的聚合物, 是一类重要的碳水化合物和渗透调节物质, 可提高植物的抗逆性；果聚糖还是一类重要的功能性食品, 对人体健康有多种促进作用。果聚糖主要是在植物由多种果糖基转移酶参与合成，果糖基转移酶的组合不同其产物果聚糖的类型也不同。2.4.1 果聚糖相关酶基因的克隆及结构、功能的研究合成不同类型的果聚糖与果糖基转移酶的酶学特性紧密联系。目前，随着生物技术水平的发展，各种不同果糖基转移酶基因在陆续克隆，使探讨调控果聚糖代谢的机制已不再是难题。自从在植物中成功克隆第一个和果聚糖代谢有密切联系的果糖基转移酶cDNA 之后[47]，其他类型的果糖基转移酶基因已被成功克隆。依照已克隆的果糖基转移酶基因序列可推出其氨基酸序列并进行分析

催化性质就会不同，从而生成的产物也就不可能相同。想要更好的弄清不同的果糖基转移酶之间存在的进化关系，依照已研究确定的果糖基转移酶基因推出的氨基酸序列制作出一个系统进化树（ 图1-3），结果表明：果糖基转移酶可分为三组类别，第 I 组是存在双子叶植物中的菊科的果糖基转移酶，又进一步分为 1-SST 和 1-FFT 这两小分支；第 II组是单子叶植物中百合科的果糖基转移酶，又进一步分为1-SST 和 6G-FFT 这两小分支；第 III 组是单子叶植物中禾本科的果糖基转移酶，关键是分为 1-SST 和 6-SFT这两小分支[52]。所以，从聚类分析的角度进一步证实：在合成果聚糖代谢中必不可少的是 1-SST，其重要作用就是把蔗糖催化成蔗果三糖。并且从聚类分析的结果看，它与合成果聚糖的代谢路径几乎吻合。
【参考文献】

相关期刊论文 前8条

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本文编号：2888415