苹果果实酸度基因挖掘验证及基因组选择模型的建立

发布时间：2020-11-18 12:15

　　 以苹果酸为主的有机酸在苹果果实风味品质中起到重要作用,解析苹果果实中苹果酸积累的遗传和分子机理,对优质育种和果实品质调控具有重要的意义。本试验利用'红玉' X '金冠'和紫塞明珠' × '红富士'等杂种群体分别对苹果果实苹果酸含量进行MapQTL和BSA-seq分析,然后在主效QTLs区间内预测候选基因并进行变异位点功能验证,最终建立基因组选择模型。主要研究结果如下:1.通过对'紫塞明珠' X '红富士'正反交群体、'紫塞明珠,× '金冠'正反交群体以及'红玉' X '金冠'群体5个杂交群体连续3年的表型进行分析,发现苹果果实酸性状为典型的数量性状,杂交后代中性状分离广泛,其广义遗传力均在80%以上,变异主要由遗传效应决定。2.利用'红玉' × '金冠'和'紫塞明珠' × '红富士'杂交群体,分别用MapQTL和BSA-seq方法对果实苹果酸含量进行QTL定位,共获得4个主效QTLs:qt108.1、qt108.2、qt108.3和qt116.1。通过苹果参考基因组基因注释和本实验室的父母本'红玉'和'金冠'的重测序库来预测筛选候选基因。最终分析结果为:MdMYB44、MdPP2CH、MdSAAUR37和MdALMTI分别为qtl08.1、qt108.2、qt108.3和qt116.1位点的候选基因。3.我们用已经开发的CAPS标记来检测杂交群体后代和种质资源中该基因MdLMTII SNP位点上A/G多态性。MdALMTII基因型(AA、AG、GG)与果实苹果酸含量显著相关(P0.01),GG基因型表现为高酸,AA表现为低酸。4.在MdPP2CH基因编码区802bp处存在一个A/GSNP位点,使编码蛋白 268位氨基酸从苏氨酸变为丙氨酸(T268A)。MdPP2CH基因型(AA、AG、GG)与果实苹果酸含量显著相关(P0.001),GG基因型个体中的苹果酸平均含量显著高于AG基因型,而AG基因型个体中的苹果酸的平均含量显著高于AA基因型,表现为加性效应。磷酸酶活性验证试验证明当氨基酸多态由Thr变为Ala时,MdPP2CH的磷酸酶活性下降,说明该SNP位点影响MdPP2CH蛋白脱磷酸化功能。在苹果愈伤中过表达MdPP2CH,转基因愈伤中的苹果酸含量显著下降,说明MdPP2CH负调控苹果酸的积累。过表达MdPP2CH(268T)的转基因愈伤中的苹果酸含量显著低于过表达MdPP2CH(268 A),说明当氨基酸多态由Thr变为Ala时会导致MdPP2CH的磷酸酶活性下降。Y2H和BiFC试验证明MdPP2CH可与苹果酸转运蛋白MdALMTII和离子通道蛋白MdVHA-A3、MdVHA-B2、MdVHA-D2互作,通过脱磷酸化抑制苹果酸转运蛋白活性,从而阻碍苹果酸转运到液泡,负向调控苹果酸的积累。5.在MdSAUR37基因起始编码子ATG上游-639 bp处有一个36-bp的插入。MdSAUR37基因型(Ⅱ、Ii、ii)与果实苹果酸含量显著相关(P0.001),插入纯合基因型Ⅱ个体中的苹果酸的含量显著高于插入杂合基因型Ii,而基因型Ii个体中的苹果酸的平均含量显著高于无插入基因型ii。果实成熟期MdSAUR37基因的表达水平与果实中苹果酸的含量显著相关(R2 = 0.7792,P0.001)。GUS染色和GUS/GFP双标签瞬时表达检测分析表明MdSAUR37基因启动子区36-bp插入能显著增强MdSAUR37基因启动子活性。MdSAUR37可以与MdPP2CH互作并抑制MdPP2CH的脱磷酸化,抑制率达35%。6.在MdMYB44基因编码区起始编码子ATG上游启动子区在-1010 bp位存在一个A/G SNP位点。MdMYB44基因型(AA、AG、GG)与果实苹果酸含量显著相关(P0.001),基因型GG个体中的苹果酸的含量显著高于基因型AG,而基因型AG个体中的苹果酸的含量显著高于基因型AA。7.对MdSAUR37/MdPP2CH/MdALMTII/MdMYB44组合基因型进行基因分型,通过用苹果酸含量平均值值为各基因的基因型赋值,经迭代运算,建立了苹果酸含量性状的基因组选择的线性模型:PPV= GV(MdSAUR37)× GV(MdPP2CH)× GV(MdALMTII)+ GV(MdMYB44)+ 校准系数(1)。该模型预测的苹果酸表型值PPV与实测的苹果酸含量显著相关(p0.001)。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S661.1
【部分图文】：

国农业大学博士学位论文?丨文献综入果肉细胞，同时也有一部分蔗糖被细胞壁庶糖酶分解为葡萄糖和果糖等己糖，而山梨醇接进入果肉细胞。进入细胞的蔗糖在蔗糖酶的催化下合成己糖（葡萄糖和果糖等），另外，醇在山梨醇脱氢酶和山梨醇氧化酶的催化下也合成己糖。一部分蔗糖和己糖转运入液泡储；而在细胞质中的己糖通过糖降解作用合成磷酸烯醇丙酮酸，磷酸稀醇丙酮酸在磷酸稀醇羧化酶（ＰＥＰＣ）的催化下生成草酰乙酸，草酰乙酸再经ＮＡＤ－苹果酸脱氢酶（ＮＡＤ－ＭＤＨ）生成苹果酸。一部分苹果酸进入线粒体中三羧酸循环途径，经过电子传递和氧化磷酸化并成ＡＴＰ，为其它代谢途径提供一定的能量；一部分苹果酸作为生物合成的前体；也有一部酸积累在液泡中，液泡膜上的质子泵为苹果酸等有机酸的跨膜转运提供驱动力（Ｌｉｉｔｇｅ，?１９Ａｓｓｉｍｉｌａｔｅｓ??????—

Ｍａ２＂?ＭａＪａｔｅ?ｃｈａｎｎｅ，??（ｍａｌａｔｅ，?ｃｉｔｒａｔｅ，?Ｃｌ＇）??图１－３果实中液泡有机酸贮藏机理（Ｅｔｉｅｎｎｅ?ｅｔａｌ．，?２０１３）??Ｆｉｇ．?１－３?４Ａｃｉｄ?ｔｒａｐ＇?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｖａｃｕｏｌａｒ?ｏｒｇａｎｉｃ?ａｃｉｄ?ｓｔｏｒａｇｅ?ｉｎ?ｆｒｕｉｔ?ｃｅｌｌｓ??３??

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本文编号：2888707