GLDC基因可变剪接体在非小细胞肺癌中的功能机制研究

发布时间：2020-11-18 19:02

　　 背景和目的:肺癌是常见的恶性肿瘤之一,非小细胞肺癌占85%。目前治疗包括手术切除、铂类为基础的联合化疗、放疗及靶向治疗,但肺癌发生机制不完全清楚。因此,探索新的关键分子,对明确肺癌发生机制及靶向治疗有重要意义。甘氨酸脱羧酶(glycine decarboxylase,GLDC)是连接甘氨酸代谢与肿瘤发生的代谢致癌基因,在肿瘤干细胞丰富的原发性非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)中过度表达,可以驱动NSCLC肿瘤干细胞,另外肿瘤干细胞的生长和致瘤能力都依赖于高水平GLDC的表达,因此GLDC可以作为干细胞表面标志物来识别肿瘤干细胞。目前GLDC已出现在多种肿瘤中,非小细胞肺癌尤为突出,与患者预后呈正相关。基因选择性剪接(alternative splicing,AS)是人类基因调控最常见的机制之一,在肿瘤的生理过程和细胞发育过程中至关重要,但GLDC在NSCLC中的选择剪切调控机制迄今未见报道,因而了解GLDC剪接体生物学作用及功能可以为今后肿瘤的早期诊断和治疗奠定理论基础。本实验旨在克隆人GLDC基因可变剪接体,分析生物学活性,为非小细胞肺癌发生机制及靶向治疗提供指导意义。方法:1.构建克隆载体:在NCBI中查找人的GLDC全长(glycine decarboxylase full length,GLDCfl)及其剪接体GLDC varient1(GLDCV1)序列,根据其cDNA设计引物,通过RT-PCR结合测序的方法检测人肺腺癌细胞A549及正常细胞MRC5中GLDCfl及GLDCV1 mRNA的表达并对其进行扩增;同时在MRC5细胞中过表达GLDCfl及GLDCV1,蛋白印迹法检测转染后蛋白表达;2.体外功能实验:用MTT法检测过表达对MRC5细胞活力的影响,BrdU、平板克隆、琼脂克隆形成实验检测对细胞增殖能力影响,RT-PCR检测过表达对干性基因标志物CD44、ALDH1的影响,同时验证是否影响乳酸生成;3.体内功能实验:用GLDCfl及GLDCV1质粒稳定转染MRC5细胞,筛选出稳转细胞后注入裸鼠皮下,以空载质粒为阴性对照,观察成瘤能力;4.用筛选好的稳转细胞验证过表达对肿瘤相关信号通路PI3K/AKT、JAK/STAT、ERK/MAPK通路蛋白表达的影响,同时验证对细胞周期蛋白表达的影响。结果:1.A549和MRC5中GLDCfl及剪接体GLDCV1在RNA水平均存在,蛋白印迹法显示蛋白水平仅A549表达;2.在体外将GLDCfl及剪接体GLDCV1过表达于MRC5细胞,48h后用MTT法检测,结果发现细胞活力增加;BrdU、琼脂克隆及平板克隆实验证明过表达会促进MRC5细胞的增殖;RT-PCR检测干细胞标志物显示过表达促进CD44和ALDH1表达;转染24h后检测乳酸生成增多;3.体内荷瘤实验证明稳转GLDCV1剪接体在裸鼠体内具有致瘤性;4.对过表达促进细胞增殖的机制进行研究,发现过表达会使ERK/MAPK信号通路上P-ERK、P-P38蛋白表达增多,说明过表达可能通过ERK/MAPK信号通路发挥促进细胞增殖的作用。同时过表达还可以使CyclinD1表达增多。结论:1.本研究分析了GLDC基因选择性剪接体在肿瘤细胞中的表达形式,并揭示了GLDC及其变体在非小细胞肺癌中的生物学作用。2.通过在MRC5中过表达GLDCfl及其剪接体GLDCV1证明过表达对MRC5的细胞活力、增殖能力、克隆形成能力、干细胞标志物、乳酸生成及成瘤能力均有促进作用。3.发现过表达可能通过ERK/MAPK信号通路发挥促进细胞增殖的作用。4.过表达GLDCfl及其剪接体GLDCV1会通过影响CyclinD1的表达促进细胞增殖。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R734.2
【部分图文】：

第 4 章 实验结果.1 GLDC 基因选择性剪接变体在非小细胞肺癌中的存在形式实验前期首次发现了 GLDCV1 的存在，为了初步判断 GLDC 基因选择性变体在非小细胞肺癌中的存在形式，利用 RT-PCR 的方法，在人正常肺细RC5 和人非小细胞肺癌细胞 A549 中进行基因扩增，根据前期实验显示，在子 1 和 6 的位置设计引物即扩增 406-1039 片段更容易鉴别和扩增出全LDCfl。遂针对片段 1-1039 和 406-1039 扩增 GLDCV1 和 GLDCfl 的引物。结果如下图 4.1 所示，在癌细胞和正常细胞中均可以扩增出与预期片段大小的片段。对片段进行胶回收测序，显示 GLDCfl 与原报道中的相同，GLDC缺失 49-448 之间 400bp 长度的片段。

2 GLDC 蛋白在非小细胞肺癌 A549 及正常肺 MR蛋白表达情况DC 及其变体的生物学作用研究过表达载体载体的构建由金唯智公司完成，所得质粒用于转 blot 的方法检测质粒表达情况，结果如下图 4.3 所V1 在 MRC5 细胞中的表达增高。

GLDC 蛋白在非小细胞肺癌 A549 及正常肺 MRC蛋白表达情况C 及其变体的生物学作用研究过表达载体载体的构建由金唯智公司完成，所得质粒用于转染 lot 的方法检测质粒表达情况，结果如下图 4.3 所示V1 在 MRC5 细胞中的表达增高。
【参考文献】

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1 刘东,李奕,张道荣;p~(21)~(WAF1)及CyclinE在非小细胞肺癌中的表达及意义[J];实用肿瘤学杂志;2002年04期

本文编号：2889082