白头翁皂苷糖基水解Ⅱ型酶分离纯化及基因的克隆
发布时间：2020-11-19 11:42
白头翁皂苷糖基水解酶能够特异性的水解白头翁皂苷上的糖苷键,使多糖基白头翁皂苷转化为低糖基白头翁皂苷,不仅能提高白头翁皂苷的生物利用率,还可以提高其药效价值。本论文主要对Absidia sp.P00r菌发酵产的白头翁皂苷糖基水解II型酶的分离纯化和基因调取进行了研究。在Absidia sp.P00r菌的液体发酵培养研究中发现,白头翁皂苷糖基水解II型酶在以70%的槐花浸出液为诱导物配制的5°麦芽汁培养基培养120 h时,产量较大,诱导效果较好。利用DEAE-Cellulose(DE52)阴离子交换柱进行分离纯化,得到电泳纯的白头翁皂苷糖基水解II型酶蛋白,将该酶通过蛋白质电印迹转膜至PVDF膜上后,经过蛋白质N-端序列测定,确定该酶N-端序列为YPDSVQHAETVQNLI。根据测得的白头翁皂苷糖基水解II型酶蛋白N-端序列和测得的肽质谱数据登陆NCBI网站和Matrixscience网站的蛋白质数据库进行比对,查找同源性,并根据同源性设计引物。根据白头翁皂苷糖基水解II型酶的N-端序列设计简并引物,以Absidia sp.P00r菌株的mRNA为模板,采用RT-PCR进行基因序列的调取;根据3’RACE和5’RACE技术扩增白头翁皂苷糖基水解II型酶的3’端和5’端的基因片段并测序,得到白头翁皂苷糖基水解II型酶的基因全序列,最后对调取的基因序列进行序列分析。白头翁皂苷糖基水解II型酶的基因全长为1376 bp,其中1~84 bp为5’UTR,长度为84 bp;85~1137 bp为基因的CDS区,长度为1053 bp;可编码351个氨基酸;1138~1365bp为3’UTR,长度为228 bp;1366~1376 bp为Poly A部分,长度为11 bp。
【学位单位】：大连工业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S567.239
【部分图文】：
3图 1-4 白头翁皂苷 A 的化学结构Fig.1-4 Chemical structure of pulchinenoside A药理作用作用白头翁可以对利福平和异烟肼引起的血清谷同时有效增强了血清谷丙转氨酶升高增加所不同浓度的白头翁皂苷可以在体外注射到小鼠吞噬作用，还可以促使它产生一定量的一氧化时维静[13]等研究发现将白头翁皂苷加入到肉鸡
R 也被称为逆转录 PCR，是聚合酶链式反应的一种广应用泛的变ACE 技术是已知全长 cDNA 序列中的某部分序列，从微量的转录本中’和 3’末端的有效方法[47]，该方法具有快捷、方便和高效等优点[4为 3’RACE 和 5’RACE[49]。E 技术原理 技术通常可分为 3’RACE 和 5’RACE，其主要依据是根据扩增区ACE 技术 Poly(A)+RNA 逆转录成带有 3’RACE Adaptor 衔接头的 cDNA 链 cDNA 作为模板进行 PCR 反应。 使用专门用于正向引物的 GS 3’RACE Outer Primer。获得已知信息区域和 poly(A)尾部区域之PCR期间可能发生非特异性条带过程，所以通常需要使用上述引物嵌套 PCR）进行 PCR 步骤，其原理如图 1-5 所示：
第一章 文献综述5’RACE 技术 3’RACE 相比，5’RACE 相对难以实现，因为 5’真核 mRNA 的末端没有特。主要步骤是：从暴露的 mRNA 中去除不完整的磷，除去 mRNA 的 5’末T4 连接酶 5’RACE 衔接子连接 mRNA。使 5’特异性序列上的引物和该序列引物结合进行 5’RT-PCR 末端的反应。其原理如图 1-6 所示。
【参考文献】
本文编号：2889990
【学位单位】：大连工业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S567.239
【部分图文】：
3图 1-4 白头翁皂苷 A 的化学结构Fig.1-4 Chemical structure of pulchinenoside A药理作用作用白头翁可以对利福平和异烟肼引起的血清谷同时有效增强了血清谷丙转氨酶升高增加所不同浓度的白头翁皂苷可以在体外注射到小鼠吞噬作用，还可以促使它产生一定量的一氧化时维静[13]等研究发现将白头翁皂苷加入到肉鸡
R 也被称为逆转录 PCR，是聚合酶链式反应的一种广应用泛的变ACE 技术是已知全长 cDNA 序列中的某部分序列，从微量的转录本中’和 3’末端的有效方法[47]，该方法具有快捷、方便和高效等优点[4为 3’RACE 和 5’RACE[49]。E 技术原理 技术通常可分为 3’RACE 和 5’RACE，其主要依据是根据扩增区ACE 技术 Poly(A)+RNA 逆转录成带有 3’RACE Adaptor 衔接头的 cDNA 链 cDNA 作为模板进行 PCR 反应。 使用专门用于正向引物的 GS 3’RACE Outer Primer。获得已知信息区域和 poly(A)尾部区域之PCR期间可能发生非特异性条带过程，所以通常需要使用上述引物嵌套 PCR）进行 PCR 步骤，其原理如图 1-5 所示：
第一章 文献综述5’RACE 技术 3’RACE 相比，5’RACE 相对难以实现，因为 5’真核 mRNA 的末端没有特。主要步骤是：从暴露的 mRNA 中去除不完整的磷，除去 mRNA 的 5’末T4 连接酶 5’RACE 衔接子连接 mRNA。使 5’特异性序列上的引物和该序列引物结合进行 5’RT-PCR 末端的反应。其原理如图 1-6 所示。
【参考文献】
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