调节金鱼草叶序发育AmPIN1a基因克隆和转基因分析
发布时间：2020-11-21 03:13
金鱼草是多年生草本植物,是玄参目玄参科金鱼草属金鱼草种。金鱼草是广泛应用的园林栽培观赏植物,拥有繁多的品种和较广的生态位,在世界切花市场也有重大地位,也是研究植物叶序变化的优良植物之一。植物叶序发育主要是由于叶原基生长点发育形成的,目前研究中发现生长素和细胞分裂素对其起到重要作用,PIN家族蛋白主要控制生长素在植物体内的运输,研究PIN家族有利于阐明植物叶序发育的部分机理。研究以金鱼草为试材,克隆了金鱼草的AmPIN1a基因,并将此基因构建到表达载体上,通过浸花法侵染拟南芥获得过表达AmPIN1a转基因拟南芥,观察其表形并用外源IAA对其进行处理,以探究金鱼草AmPIN1a基因的功能。获得了如下主要结果:1.本实验研究以金鱼草为研究材料,通过对金鱼草幼芽顶端分生组织转录组文库分析发现。在同一时期金鱼草的对生叶序枝条和互生叶序枝条间PIN1基因表达量有较大差异。利用NCBI通过Blast同源搜索寻找到金鱼草同源PIN1a基因,根据搜索到的序列设计引物,利用PCR技术从金鱼草中克隆出AmPIN1a基因。2.通过荧光定量PCR,对AmPIN1a基因在金鱼草中的组织表达模式进行分析,发现AmPIN1a在金鱼草生长周期内不同器官中都有表达,幼苗期表达量:茎根叶,成年期表达量:茎叶花根。3.AmPIN1a基因全长CDS为1836bp,和其他物种PIN基因同源性较高;编码611个氨基酸,相对分子质量为66.78kD,等电点为8.95,编码的蛋白是亲水型蛋白质;氨基酸序列分析显示其蛋白含有2个Mem_trans superfamily结构域。4.构建了过表达载体pCAMBIA1301::35S-AmPIN1a,通过电击法转入农杆菌GV1301中,利用浸花法侵染野生型拟南芥并经过数代筛选得到了纯合子AmPIN1a转基因拟南芥。5.种植野生型拟南芥和AmPIN1a转基因拟南芥并观察发现,在0-12天时AmPIN1a转基因拟南芥主根略短于野生型拟南芥,侧根数量明显增多。移栽土壤后前期叶片大小也小于野生型,24天左右后叶片才超过野生型,并显著区别,花序轴萌发晚,但发育较快。6.在外源IAA处理下,发现过表达AmPIN1a基因的拟南芥相比野生型拟南芥表现出对IAA刺激更加敏感的性状,暗示该基因可能在植物生长素运输中起到相关作用。
【学位单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S682.19
【部分图文】：
图 1.2 图为三种野生的拟南芥顶端分生组织[20]A：电子显微镜下，顶端分生组织（SAM）和五个中的两个可见的花分生组织(FM)。花分生组织每次以螺旋的方式进行排列，因此可以通过观察花分生组织来判断花分生组织的生长时期。花分生组织成熟的标志是拥有了 4 片萼片原基。B：茎尖电子显微镜扫描结果显示顶端分生组织和刚形成的花分生组织和老的花分生组织。C：图 1B 中的顶端分生组织详情。较少的细胞组成了顶端分生组织。标尺是 50um。Fig 1.2 Three Views of SAMs of Arabidopsis (Ler Wild-Type)A: Scanning electron micrograph, with SAM and two of the five visible floral meristems (FM) indicated. FMs areinitiated in a spiral pattern and one at a time, so the meristems that are visible show different stages of FM growth.The most mature is initiating four sepal primordia.(B) Transmission electron micrograph of a similar apex, showing SAM and a recently initiated FM as well as anolder FM.(C) Detail of the SAM shown in Figure 1B. Note how few cells constitute the SAM. Scale bars: 50 um.茎顶端分生组织形成分化产生叶原基，叶原基出现后自身形成分化产生叶片，这一过程称为叶片的发育过程。叶基、叶形、叶脉、叶缘和叶尖是叶片的重要外部特征，是不同物种间分辨的重要依据。除了复叶外，成熟的单叶有 3 个不对称轴，分别是：基-顶轴(由叶的基部指向尖部)；和中-边轴(从叶的主脉指向边缘)；腹[21]
图 1.3 PIN 蛋白的预测结构[75]Fig 1.3. The predicted structure of PIN proteinsIN 基因的表达既具有组织和器官特异性，又有重叠性。P定了其在发育中扮演了特定的角色。PIN1 是 PIN 家族中研1 突变体的表型是 PIN 基因家族成员突变体表型最明显的，PIN1 基因在拟南芥的各个器官均有转录。利用 PIN1 蛋(immunolocalization)，结果显示在根尖的中柱组织和内皮1 蛋白的信号，在表皮细胞和皮层细胞的底部细胞膜上也 PIN1 介导生长素向根尖运输，在花序茎中 PIN1 蛋白定位的底部细胞膜上。IN 家族中，PIN1 蛋白是唯一能在茎尖生长点有表达信号的IN1 朝向高浓度生长素的细胞膜上极性定位，增强生长素期膨胀的原基和其临近的区域形成一个生长素释放区，诱已经存在的原基一定距离的地方形成。在胚发育过程中有明显的动态变化。1-16 细胞期时，PI
图 3.1 pCAMBIA1301::35S-AmPIN1a 过表达载体构建Fig 3.1 Construct of expression vectors of pCAMBIA1301::35S-AmPIN1a载体构建过程如下：一）提取 pCAMBIA1301 质粒从安徽农业大学安徽省作物生物学重点实验室保存的含有 pCAMBIA1301 载质粒的大肠杆菌中提取 pCAMBIA1301 载体质粒。1) 先将水浴锅预热 65oC。提取在 LB 液体培养中培养过夜的菌液 1-4mL，放入L EP 管中，设置程序为 12000×g 离心 1min，丢弃上清液。2) 在菌体沉淀中加入 250μL 的 Buffer S1（需事先加入 RNase A）悬浮菌体沉淀枪头打碎混匀，不要留有小的菌块。3) 在 EP 管中加入 250μL Buffer S2，温和上下颠倒混匀 4.6 次，让细菌充分裂解到溶液变得透亮，开瓶盖时候会有拔丝状物质，注意时间不要超过 5min。4) 再在 EP 管中加入 350μL Buffer SS 温和上下颠倒混匀 6-8 次，设置程序为2000×g 离心 10min。5) 吸取 4 步骤中的上清液转移到制备管中，将制备管放入 2mL 离心管中，设置
【参考文献】
本文编号：2892434
【学位单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S682.19
【部分图文】：
图 1.2 图为三种野生的拟南芥顶端分生组织[20]A：电子显微镜下，顶端分生组织（SAM）和五个中的两个可见的花分生组织(FM)。花分生组织每次以螺旋的方式进行排列，因此可以通过观察花分生组织来判断花分生组织的生长时期。花分生组织成熟的标志是拥有了 4 片萼片原基。B：茎尖电子显微镜扫描结果显示顶端分生组织和刚形成的花分生组织和老的花分生组织。C：图 1B 中的顶端分生组织详情。较少的细胞组成了顶端分生组织。标尺是 50um。Fig 1.2 Three Views of SAMs of Arabidopsis (Ler Wild-Type)A: Scanning electron micrograph, with SAM and two of the five visible floral meristems (FM) indicated. FMs areinitiated in a spiral pattern and one at a time, so the meristems that are visible show different stages of FM growth.The most mature is initiating four sepal primordia.(B) Transmission electron micrograph of a similar apex, showing SAM and a recently initiated FM as well as anolder FM.(C) Detail of the SAM shown in Figure 1B. Note how few cells constitute the SAM. Scale bars: 50 um.茎顶端分生组织形成分化产生叶原基，叶原基出现后自身形成分化产生叶片，这一过程称为叶片的发育过程。叶基、叶形、叶脉、叶缘和叶尖是叶片的重要外部特征，是不同物种间分辨的重要依据。除了复叶外，成熟的单叶有 3 个不对称轴，分别是：基-顶轴(由叶的基部指向尖部)；和中-边轴(从叶的主脉指向边缘)；腹[21]
图 1.3 PIN 蛋白的预测结构[75]Fig 1.3. The predicted structure of PIN proteinsIN 基因的表达既具有组织和器官特异性，又有重叠性。P定了其在发育中扮演了特定的角色。PIN1 是 PIN 家族中研1 突变体的表型是 PIN 基因家族成员突变体表型最明显的，PIN1 基因在拟南芥的各个器官均有转录。利用 PIN1 蛋(immunolocalization)，结果显示在根尖的中柱组织和内皮1 蛋白的信号，在表皮细胞和皮层细胞的底部细胞膜上也 PIN1 介导生长素向根尖运输，在花序茎中 PIN1 蛋白定位的底部细胞膜上。IN 家族中，PIN1 蛋白是唯一能在茎尖生长点有表达信号的IN1 朝向高浓度生长素的细胞膜上极性定位，增强生长素期膨胀的原基和其临近的区域形成一个生长素释放区，诱已经存在的原基一定距离的地方形成。在胚发育过程中有明显的动态变化。1-16 细胞期时，PI
图 3.1 pCAMBIA1301::35S-AmPIN1a 过表达载体构建Fig 3.1 Construct of expression vectors of pCAMBIA1301::35S-AmPIN1a载体构建过程如下：一）提取 pCAMBIA1301 质粒从安徽农业大学安徽省作物生物学重点实验室保存的含有 pCAMBIA1301 载质粒的大肠杆菌中提取 pCAMBIA1301 载体质粒。1) 先将水浴锅预热 65oC。提取在 LB 液体培养中培养过夜的菌液 1-4mL，放入L EP 管中，设置程序为 12000×g 离心 1min，丢弃上清液。2) 在菌体沉淀中加入 250μL 的 Buffer S1（需事先加入 RNase A）悬浮菌体沉淀枪头打碎混匀，不要留有小的菌块。3) 在 EP 管中加入 250μL Buffer S2，温和上下颠倒混匀 4.6 次，让细菌充分裂解到溶液变得透亮，开瓶盖时候会有拔丝状物质，注意时间不要超过 5min。4) 再在 EP 管中加入 350μL Buffer SS 温和上下颠倒混匀 6-8 次，设置程序为2000×g 离心 10min。5) 吸取 4 步骤中的上清液转移到制备管中，将制备管放入 2mL 离心管中，设置
【参考文献】
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本文编号：2892434
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