基于关联分析及全基因组测序的先天性巨结肠症易感基因研究

发布时间：2020-11-21 04:38

　　 第一章基于病例对照及荟萃分析的NRG1多态性与先天性巨结肠症易感性研究背景:先天性巨结肠症(Hirschsprung disease,HD)是肠神经系统(Enteric nervous system,ENS)发育畸形最常见的类型,其易感性与基因多态性密切相关。NRG1基因是通过全基因组关联研究首次在中国人群发现的HD易感基因,其多态性位点rs7835688、rs16879552与HD发病密切相关。迄今为止,已有多项病例-对照分子流行病学研究在不同人群中对这2个位点与HD的易感性进行了重复与验证,但结论并不一致。因此本文拟进一步深入探讨rs7835688、rs16879552多态性与HD遗传易感性之间的关系。方法:(1):首先采用大样本病例-对照分子流行病学关联性分析,定点研究NRG1基因rs7835688、rs16879552位点与中国人群HD发病风险的关系。(2)利用公共数据库(Pub Med、EMBASE、Web of Science)检索已发表的文章数据,结合前一步的Taq Man基因分型数据进行荟萃分析,讨论rs7835688、rs16879552与HD的关联。(3)将所有的研究对象分为黄种人与白种人二个人群进行亚组分析,探索rs7835688、rs16879552与不同种族之间的人种-基因交互作用。(4)根据HD的临床类型,将其分为短段型、长段型/全结肠型二个亚组,探讨rs7835688、rs16879552与不同临床类型HD之间的基因-表型交互作用。结果:(1)病例-对照关联分析显示,无论在何种遗传模式下,rs7835688与HD的患病风险均呈正相关,而rs16879552则与HD的患病风险并无关联。(2)荟萃分析一共纳入9项临床研究,7项关于亚洲人,2项研究对象为白种人。所有文献均采用病例-对照设计,其中2篇为全基因组关联分析(GWAS),7篇为基因定点分析(Fine-mapping)。对所有文献的对照组基因型分布进行哈-温平衡验证,其中5篇符合哈-温平衡标准,另外4篇由于基因型频率数据不完整而无法计算。5项研究对照组来源于社区人群,4项研究对照组来源于医院人群。(3)在所有遗传模型中,rs7835688均增加HD患病风险;对于rs16879552,除了显性遗传模型下与HD无明显关联,其他三种遗传模型下rs16879552等位基因C均明显增加HD易感性。(4)基于人种的亚组分析显示,对于rs7835688,4种遗传模型下均与黄种人HD易感性相关,而与白种人无明显关联;对于rs16879552,在纯合模型、隐性模型、等位基因模型下与黄种人HD风险显著相关,但与白种人HD遗传易感性无关联。(5)基于HD临床分型的亚组分析显示,rs7835688在4种遗传模型下均与短段型HD易感性相关,但不增加长段型/全结肠型HD的患病风险;而rs16879552仅在等位基因模型下与长段型/全结肠型HD相关。结论:NRG1基因多态性位点rs7835688、rs16879552可增加亚洲人群HD遗传易感性,但与白种人HD患病风险之间的关系并不确切,其潜在的生物学机制尚需更多研究去进行探讨。第二章全基因组测序筛选先天性巨结肠症新易感基因ALK及其功能鉴定背景:先天性巨结肠症(HD)是引起小儿功能性肠梗阻最主要的消化道畸形,属于肠神经系统(ENS)发育异常性疾病,结肠粘膜下及肌间神经节细胞缺失是该病主要的病理改变,肠神经嵴细胞(ENCC)在ENS发育过程中迁移停滞是引起HD的内在原因。ENCC在定植分化为肠神经元的过程中,必须适应不断变化的肠道微环境,整个过程由来源于神经嵴和肠道微环境的特定信号通路分子和转录因子调控。任何编码这些分子的基因发生突变,都有可能影响到整个ENCC的定植过程,成为HD的致病基因。目前已知的基因及其变异位点并不能解释所有HD病例发病原因,因此本研究主要通过全基因组测序,系统绘制HD相关的基因组变异图谱,筛选出新的易感基因。在此基础上,进行进一步的功能验证,探索基因突变对ENCC生物学行为的影响。方法:(1)收集13份全结肠巨结肠患儿及其父母外周血标本,提取基因组DNA进行全基因组测序。通过生物信息学分析过滤各种遗传变异,鉴定出与HD发病相关的显著突变基因。(2)NCBI GEO Datasets数据库查找突变基因ALK在人体胚胎组织的表达情况。(3)免疫组织化学技术、PCR及Western-blot检测ALK在病变组织及正常结肠中的表达差异。(4)用携带ALK sh RNA的敲低载体转染原代培养的ENCC,通过MTT实验、RTCA细胞实时分析实验观察该基因敲低对ENCC增殖、迁移能力的影响。结果:(1)基因编码区发现了2149个突变,其中ACMG预测为有害/可能有害的突变有1927个,共有突变筛选发现222个突变。(2)采用SIFT、Polyphen、Mutation Taster、CADD等软件对筛选出来的位点进行受累氨基酸化学性质分析、序列保守性分析及生物信息学预测,最终确定ALK为新的HD候选基因。ALK基因在2例患儿中存在突变,其中1例为纯合突变:c.C1648T[p.L550F];另一个样本中为复合杂合突变:c.C3035T[p.T1012M]与c.G487T[p.V163L]。(3)数据库中RNA表达谱芯片数据集显示ALK于胚胎期在胃及结肠组织中的表达明显高于其他组织。(4)ALK主要表达于肠神经节及神经纤维,位于胞浆及细胞膜。与正常结肠组织相比,基因突变患儿狭窄段结肠ALK m RNA及蛋白表达明显降低。(5)在ENCC细胞系中运用sh RNA技术敲低ALK表达后细胞的增殖及迁移能力明显降低。结论:(1)采用全基因组测序技术对先天性巨结肠的各类遗传变异进行了筛选,包括In Dels、SNV、SV及CNV等,筛选出ALK基因错义突变可能与HD的发病密切相关。(2)ALK与ENCC的生物学行为密切相关,其表达降低可抑制ENCC的增殖与迁移能力。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R726.5
【部分图文】：

一共有9 项临床研究探讨了 rs7835688 和/或 rs16879552 与 HD 的遗传易感性。研究路线如图1 所示。图 1 荟萃分析技术路线图3、纳入研究基本情况9 项临床研究中，7 项关于亚洲人[5, 12, 18-22]，2 项研究对象为白种人[13, 14]。所有文献均采用病例-对照设计，其中 2 篇为全基因组关联分析（GWAS），7 篇为基因定点分析（Fine-mapping）。我们对所有文献的对照组基因型分布进行哈-温平衡验证，其中 5 篇符合哈-温平衡标准，另外 4 篇由于基因型频率数据不完整而无法计算。5 项研究对照组来源于社区人群（P-B），4 项研究采用以医院为基础的病例-对照设计（H-B）。各研究的基本特征在表 3 中具体描述。纳入文献的评分在 9-11 分之间

rs7835688与HD患病风险的关联性

中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文检验及发表偏倚（rs7835688）目遗传模型 异质性检验 发Q P value I2(%) BegCC vs GG 20.5 3.977E-04 80.5 –CC vs CG+GG 32.62 1.430E-06 87.7 –CC+CG vs GG 9.57 4.838E-02 58.2 –C vs G 30.67 7.141E-05 77.2 0
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 陈烁;周春菊;马晓莉;宫丽平;;儿童神经母细胞瘤ALK基因及其表达的异常[J];中华病理学杂志;2014年08期

2 Adam S Wallace;Richard B Anderson;;Genetic interactions and modifi er genes in Hirschsprung's disease[J];World Journal of Gastroenterology;2011年45期

本文编号：2892536