大豆GmCBL2基因的克隆及功能鉴定

发布时间：2020-11-21 22:57

　　 植物在生长发育过程中会受到很多非生物胁迫的威胁,例如高pH、氧化、干旱、热、盐等胁迫,都严重影响着植物的生长发育。Ca~(2+)是植物中普遍存在的第二信使,广泛参与植物的生长状态、衰老速度的调控,在响应生物胁迫和非生物胁迫等方面也起着重要的作用。钙调磷酸酶B亚基蛋白(calcineurin B-like protein,CBL)是一组钙离子感受器,能够与一类蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase,CIPK)互作来解码特异Ca~(2+)信号,从而对逆境胁迫作出响应。CBL家族在许多物种中都有研究,但目前对大豆CBL家族的研究较少。本文以“黑农52”为实验材料,应用qRT-PCR技术分析了高pH、高镁、氧化胁迫条件下大豆GmCBL2基因的表达模式,并分析了该基因的生物信息学特征;通过同源克隆技术,从大豆中克隆了与拟南芥AtCBL2基因同源的GmCBL2基因,并构建了GmCBL2基因的植物过表达载体,将该基因成功转化到烟草中。对转基因植株进行抗逆性分析,确定了该基因与非生物胁迫耐受性的关系。获得的主要研究成果如下:1.GmCBL2基因在逆境胁迫下的表达模式分析对大豆幼苗分别进行高pH(100mmol/L NaHCO_3)、高镁(20mmol/L MgCl_2)、氧化(10mmol/L H_2O_2)胁迫处理,通过qRT-PCR分析GmCBL2基因在0、1、5、12、24h的表达模式,结果表明,GmCBL2基因对三种胁迫均有不同程度的应答,但被氧化胁迫诱导最显著。2.GmCBL2基因的克隆与序列分析根据拟南芥AtCBL2基因序列在大豆数据库(www.Phytozome.com/soybean)进行同源比对获得大豆同源序列GmCBL2,通过RT-PCR克隆获得GmCBL2基因CDS序列,该序列全长681bp,编码226个氨基酸。氨基酸序列比对和系统进化分析表明,GmCBL2蛋白与木豆中的同源蛋白的亲缘关系最近。3.GmCBL2基因对烟草的遗传转化构建了pBWA(V)HS-GmCBL2植物过表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,获得了转GmCBL2基因的PCR阳性植株。RT-PCR结果证明GmCBL2已在转录水平表达。4.转基因烟草的抗逆性鉴定对转基因植株进行了100mmol/L NaHCO_3、10mmol/L H_2O_2、20mmol/L MgCl_2胁迫下的表型分析,结果发现,转基因植株和野生型植株离体叶片在高pH、高镁胁迫下叶片均黄化,但在氧化胁迫下转基因植株叶片仍然保持鲜绿,而野生型叶片黄化明显。对转基因植株进行了10mmol/L H_2O_2胁迫下的氧化胁迫相关生理指标(POD、CAT、SOD、MDA)分析,结果表明,转基因植株清除活性氧自由基的能力总体高于野生型植株,表明GmCBL2能够通过提高抗氧化酶活性来增强植株对氧化胁迫的抗性。
【学位单位】：哈尔滨师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

哈尔滨师范大学硕士学位论文个 CBL 成员都有自己的位置特点和功能属性。例如，CBL1，CBL4，CBL5L9 具有双重脂质修饰位点的 N 端（MGCXXS）[14]；CBL4 的脂质修饰位点赖氨酸残基（KKKKK），推测该区域有助于与磷脂之间的相互作用[15]。CBL19 主要定位在细胞质膜上[16]，但 CBL4和 CBL5 则在全细胞中均存在定位[17]。 的 N 末端由 21 个疏水性氨基酸残基替代脂质修饰结构域，使自身能够从液靶向到细胞质膜[18]。Lin 等人也证明 CBL10 被磷酸化后可以与细胞质膜结究还表明，负责细胞质膜靶向的 N 末端疏水残基约为 25 个氨基酸组成[19]。CBL3 和 CBL6 具有延伸的 N 端，它负责 CBL 蛋白的液泡膜定位[17]。此外，是由 N 端的三个半胱氨酸残基的脂质修饰作用而成[20]。CBL3 和 CBL6 定位膜上[14]，而 CBL7 和 CBL8 存在于细胞质和细胞核中[19]。相关数据还显示族能够感知由胁迫应激引起的胞质钙信号，并作为压力信号传导。

6图 1-2 植物应答逆境的 CBL-CIPK 信号途径[34, 49]Fig.1-2 CBL-CIPK signal pathway of plants response to stresses. 展望述，CBL-CIPK 网络信号系统可以响应植物对逆境的应答IPK 复合体传递逆境 Ca2+信号的过程。尽管在该领域很多研但是仍有很多 CBLs 未知功能有待研究。目前已经从拟南芥抗逆基因，也从一些模式植物中了解到一些相关生化机理一复杂通路，仍需要关于 CBL-CIPK 功能机理的更多研究作物耐逆新品种的育种实践。

图 2-3 三种胁迫下 GmCBL2 基因的表达模式Fig.2-3 The expression patterns of GmCBL2 gene under different stresses2.4 讨论植物在生长发育过程中会受到各种环境因子的影响，不良的环境因子会抑制甚至损害植物的正常生长发育。基因在不同时间段、不同胁迫条件下的表达特征可以反映出基因在抵御逆境过程中的功能特点。目前已有越来越多的研究表明CBL 家族对植物的不同胁迫有响应。拟南芥基因组含有 10 个 CBL 基因，大多基因都参与胁迫信号传导途径[3]。已有研究表明 AtCBL2 基因参与高 pH 和镁胁迫的信号转导[35]，因此本试验也进行了高 pH 和高镁处理，来检测 GmCBL2 是否也具有这样的功能。拟南芥 AtCBL2和 AtCBL3 在高镁环境下，可以与下游靶细胞结合，从而防止植物受其侵害[35]，进一步研究发现，AtCIPK3/9/23/26 与 AtCBL2/3 是在液泡膜上进行互作，可以将细胞内多余的 Mg2+流入液泡，而且 Atcipk3/9/23/26 突变体同样对 Mg2+有高度的敏感性[34-35]
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