牛支原体武威株脂蛋白P48基因的克
发布时间：2020-11-22 00:23
【目的】验证牛支原体P48蛋白在细胞中的位置,并为后续功能的研究奠定基础.【方法】运用Overlap PCR扩增获得点突变后的牛支原体武威分离株P48基因,并将其克隆至pGEM-T Easy,将测序正确的质粒克隆至表达载体pET-28a中,构建原核表达质粒pET-P48,表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),并在IPTG诱导下成功获得融合蛋白表达产物rMbP48,大小约为51ku.重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.在分离牛支原体膜蛋白的基础上应用Western-blot及间接ELISA对P48蛋白在细胞中的分布进行分析.【结果】P48蛋白主要存在于牛支原体的膜分离相.全菌免疫荧光试验进一步证实脂蛋白P48位于牛支原体的膜表面.【结论】牛支原体P48蛋白是存在于牛支原体表面的一种具有免疫原性的脂蛋白.本研究为进一步研究P48蛋白的生物学特性及建立高效的牛支原体诊断方法奠定了基础.
【部分图文】：
第２期胡国明等：牛支原体武威株脂蛋白Ｐ４８基因的克垄原核表达及亚细胞定位并连接转化，阳性质粒酶切鉴定并测序，鉴定正确的重组表达质粒命名为ｐＥＴ－Ｐ４８（图２）．Ｍ：ＤＮＡ分子质量标准；１：牛支原体武威株Ｐ４８基因．图１牛支原体Ｐ４８基因的ＰＣＲ鉴定Ｆｉｇ．１ＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰ４８ｇｅｎｅｆｒｏｍｍｙｃｏｐｌａｓｍａｂｏｖｉｓＭ：ＤＮＡ分子质量标准；１：ｐＥＴ－Ｐ４８酶切鉴定．图２重组质粒ｐＥＴ－Ｐ４８的酶切鉴定Ｆｉｇ．２ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ－Ｐ４８２．２序列分析牛支原体武威分离株Ｐ４８基因在ＮＣＢＩ中的ＢＬＡＳＴ检测结果显示，该基因在牛支原体ＨＢ０８０１株、Ｈｕｂｅｉ－１株、ＰＧ４５株及ＣＱ－Ｗ７０株中均存在，且所有分离株的Ｐ４８基因序列同源性为１００％．Ｐ４８基因与无乳支原体的某些基因亦有很高的同源性，其中与Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅＰＧ２（ＩＤ：ＣＵ１７９６８０．１）、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅｐ４８ａｎｄｐ５９ｇｅｎｅｓ（ＩＤ：ＡＪ１３２４２３．１）、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ５６３２（ＩＤ：ＦＰ６７１１３８．１），同源性均达到８０％（表３），且上述３个基因与牛支原体Ｐ４８基因相比均存在两处共９个碱基的缺失．虽然牛支原体Ｐ４８基因与无乳支原体上述３个基因具有较高的同源性，但与无乳支原体其他菌株序列具有较大差异，遗传距离较远（图３）．除此之外，在其他种属支原体基因组中均未
第２期胡国明等：牛支原体武威株脂蛋白Ｐ４８基因的克垄原核表达及亚细胞定位并连接转化，阳性质粒酶切鉴定并测序，鉴定正确的重组表达质粒命名为ｐＥＴ－Ｐ４８（图２）．Ｍ：ＤＮＡ分子质量标准；１：牛支原体武威株Ｐ４８基因．图１牛支原体Ｐ４８基因的ＰＣＲ鉴定Ｆｉｇ．１ＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰ４８ｇｅｎｅｆｒｏｍｍｙｃｏｐｌａｓｍａｂｏｖｉｓＭ：ＤＮＡ分子质量标准；１：ｐＥＴ－Ｐ４８酶切鉴定．图２重组质粒ｐＥＴ－Ｐ４８的酶切鉴定Ｆｉｇ．２ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ－Ｐ４８２．２序列分析牛支原体武威分离株Ｐ４８基因在ＮＣＢＩ中的ＢＬＡＳＴ检测结果显示，该基因在牛支原体ＨＢ０８０１株、Ｈｕｂｅｉ－１株、ＰＧ４５株及ＣＱ－Ｗ７０株中均存在，且所有分离株的Ｐ４８基因序列同源性为１００％．Ｐ４８基因与无乳支原体的某些基因亦有很高的同源性，其中与Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅＰＧ２（ＩＤ：ＣＵ１７９６８０．１）、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅｐ４８ａｎｄｐ５９ｇｅｎｅｓ（ＩＤ：ＡＪ１３２４２３．１）、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ５６３２（ＩＤ：ＦＰ６７１１３８．１），同源性均达到８０％（表３），且上述３个基因与牛支原体Ｐ４８基因相比均存在两处共９个碱基的缺失．虽然牛支原体Ｐ４８基因与无乳支原体上述３个基因具有较高的同源性，但与无乳支原体其他菌株序列具有较大差异，遗传距离较远（图３）．除此之外，在其他种属支原体基因组中均未
；２：ＣＱ－Ｗ０７；３：ＨＢ０８０１；４：Ｈｕｂｅｉ－１；５：Ｍａ５６３２；６：ＭａＰ４８ａｎｄＰ５９；７：ＭａＰＧ２；８：ＭａｓｔｒａｉｎＰＫ０１ＡＲＰ４８ｇｅｎｅ；９：ＭａｓｔｒａｉｎＲＬ１４／９５－９６Ｐ４８ｇｅｎｅ；１０：Ｐ４８ｇｅｎｅ；１１：Ｍａｓｔｒａｉｎ１７／９５－９５Ｐ４８ｇｅｎｅ；１２：ＭａｓｔｒａｉｎＶＰ１２／０５Ｐ４８ｇｅｎｅ．Ｍ：ＤＮＡ分子质量标准；１：ｐＥＴ－Ｐ４８酶切鉴定．图３Ｐ４８基因核苷酸进化树分析Ｆｉｇ．３ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰ４８ｇｅｎｅ２．３重组蛋白的表达将重组表达质粒ｐＥＴ－Ｐ４８转入大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经终浓度为１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导，获得重组蛋白的可溶性表达产物与预期一致，其分子量大小约为５１ｋｕ（图４）．２．４兔抗ｒＭｂＦ８多抗的制备及Ｐ４８的亚细胞定位采集Ｐ４８重组蛋白４免后的新西兰大白兔血液分离血清，所得多克隆抗体效价高达１∶２５６００．牛支原体胞浆蛋白、膜蛋白Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测结果显示，牛支原体Ｐ４８蛋白绝大部分存在于外膜（图５）．ＥＬＩＳＡ结果进一步证明牛支原体Ｐ４８蛋白在膜表面所占比例远大于胞浆蛋白（图６）．免疫荧光试验结果显示，抗ｒＭｂＦ４８重组蛋白多克隆抗体处理的支原体表面可结合荧光标记的二抗，从而可见明显的荧光，而阴性血清处理的牛支原５
本文编号：2893826
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第２期胡国明等：牛支原体武威株脂蛋白Ｐ４８基因的克垄原核表达及亚细胞定位并连接转化，阳性质粒酶切鉴定并测序，鉴定正确的重组表达质粒命名为ｐＥＴ－Ｐ４８（图２）．Ｍ：ＤＮＡ分子质量标准；１：牛支原体武威株Ｐ４８基因．图１牛支原体Ｐ４８基因的ＰＣＲ鉴定Ｆｉｇ．１ＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰ４８ｇｅｎｅｆｒｏｍｍｙｃｏｐｌａｓｍａｂｏｖｉｓＭ：ＤＮＡ分子质量标准；１：ｐＥＴ－Ｐ４８酶切鉴定．图２重组质粒ｐＥＴ－Ｐ４８的酶切鉴定Ｆｉｇ．２ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ－Ｐ４８２．２序列分析牛支原体武威分离株Ｐ４８基因在ＮＣＢＩ中的ＢＬＡＳＴ检测结果显示，该基因在牛支原体ＨＢ０８０１株、Ｈｕｂｅｉ－１株、ＰＧ４５株及ＣＱ－Ｗ７０株中均存在，且所有分离株的Ｐ４８基因序列同源性为１００％．Ｐ４８基因与无乳支原体的某些基因亦有很高的同源性，其中与Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅＰＧ２（ＩＤ：ＣＵ１７９６８０．１）、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅｐ４８ａｎｄｐ５９ｇｅｎｅｓ（ＩＤ：ＡＪ１３２４２３．１）、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ５６３２（ＩＤ：ＦＰ６７１１３８．１），同源性均达到８０％（表３），且上述３个基因与牛支原体Ｐ４８基因相比均存在两处共９个碱基的缺失．虽然牛支原体Ｐ４８基因与无乳支原体上述３个基因具有较高的同源性，但与无乳支原体其他菌株序列具有较大差异，遗传距离较远（图３）．除此之外，在其他种属支原体基因组中均未
第２期胡国明等：牛支原体武威株脂蛋白Ｐ４８基因的克垄原核表达及亚细胞定位并连接转化，阳性质粒酶切鉴定并测序，鉴定正确的重组表达质粒命名为ｐＥＴ－Ｐ４８（图２）．Ｍ：ＤＮＡ分子质量标准；１：牛支原体武威株Ｐ４８基因．图１牛支原体Ｐ４８基因的ＰＣＲ鉴定Ｆｉｇ．１ＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰ４８ｇｅｎｅｆｒｏｍｍｙｃｏｐｌａｓｍａｂｏｖｉｓＭ：ＤＮＡ分子质量标准；１：ｐＥＴ－Ｐ４８酶切鉴定．图２重组质粒ｐＥＴ－Ｐ４８的酶切鉴定Ｆｉｇ．２ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ－Ｐ４８２．２序列分析牛支原体武威分离株Ｐ４８基因在ＮＣＢＩ中的ＢＬＡＳＴ检测结果显示，该基因在牛支原体ＨＢ０８０１株、Ｈｕｂｅｉ－１株、ＰＧ４５株及ＣＱ－Ｗ７０株中均存在，且所有分离株的Ｐ４８基因序列同源性为１００％．Ｐ４８基因与无乳支原体的某些基因亦有很高的同源性，其中与Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅＰＧ２（ＩＤ：ＣＵ１７９６８０．１）、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅｐ４８ａｎｄｐ５９ｇｅｎｅｓ（ＩＤ：ＡＪ１３２４２３．１）、Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ５６３２（ＩＤ：ＦＰ６７１１３８．１），同源性均达到８０％（表３），且上述３个基因与牛支原体Ｐ４８基因相比均存在两处共９个碱基的缺失．虽然牛支原体Ｐ４８基因与无乳支原体上述３个基因具有较高的同源性，但与无乳支原体其他菌株序列具有较大差异，遗传距离较远（图３）．除此之外，在其他种属支原体基因组中均未
；２：ＣＱ－Ｗ０７；３：ＨＢ０８０１；４：Ｈｕｂｅｉ－１；５：Ｍａ５６３２；６：ＭａＰ４８ａｎｄＰ５９；７：ＭａＰＧ２；８：ＭａｓｔｒａｉｎＰＫ０１ＡＲＰ４８ｇｅｎｅ；９：ＭａｓｔｒａｉｎＲＬ１４／９５－９６Ｐ４８ｇｅｎｅ；１０：Ｐ４８ｇｅｎｅ；１１：Ｍａｓｔｒａｉｎ１７／９５－９５Ｐ４８ｇｅｎｅ；１２：ＭａｓｔｒａｉｎＶＰ１２／０５Ｐ４８ｇｅｎｅ．Ｍ：ＤＮＡ分子质量标准；１：ｐＥＴ－Ｐ４８酶切鉴定．图３Ｐ４８基因核苷酸进化树分析Ｆｉｇ．３ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰ４８ｇｅｎｅ２．３重组蛋白的表达将重组表达质粒ｐＥＴ－Ｐ４８转入大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经终浓度为１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导，获得重组蛋白的可溶性表达产物与预期一致，其分子量大小约为５１ｋｕ（图４）．２．４兔抗ｒＭｂＦ８多抗的制备及Ｐ４８的亚细胞定位采集Ｐ４８重组蛋白４免后的新西兰大白兔血液分离血清，所得多克隆抗体效价高达１∶２５６００．牛支原体胞浆蛋白、膜蛋白Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测结果显示，牛支原体Ｐ４８蛋白绝大部分存在于外膜（图５）．ＥＬＩＳＡ结果进一步证明牛支原体Ｐ４８蛋白在膜表面所占比例远大于胞浆蛋白（图６）．免疫荧光试验结果显示，抗ｒＭｂＦ４８重组蛋白多克隆抗体处理的支原体表面可结合荧光标记的二抗，从而可见明显的荧光，而阴性血清处理的牛支原５
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