三角帆蚌贝壳hic基质蛋白基因的克隆鉴定及功能初探

发布时间：2020-11-22 01:18

　　 三角帆蚌(Hypriosis cumingii)是中国重要的淡水育珠蚌,所产珍珠在总产量中的比值较大(约80%)。贝壳及珍珠钙化层中有机基质的重要成分基质蛋白在调控无机矿物碳酸钙的晶貌和晶型等方面发挥着重要作用。因此,鉴定和研究其功能对理解贝壳形成机理及提高珍珠质量具有重要的意义。本实验从三角帆蚌中分离得到3个与贝壳钙化相关的基因,并通过分子手段探究了其在矿化过程中的生物学功能。1.从三角帆蚌外套膜组织中克隆得到三个基质蛋白基因(hichin、hic14、hic19)。通过序列分析、结构预测、组织定量、原位杂交以及各时期珍珠囊组织荧光定量,对其功能进行了研究。RACE实验后拼接得到hichin基因全长为645bp,其中543bp为开放阅读框,编码180aa,理论等电点(pI)4.63,预测分子量(Mw)20.3kDa,包含一个ChtBD2结构域,预测蛋白高级结构与无脊椎动物几丁质结合蛋白有高度相似性。Hic14全长586bp,456bp为开放阅读框,编码151aa,pI 6.32,Mw 14.5kDa,序列中存在GS、GSG、SGS重复序列。Hic19全长1127bp,579bp为开放阅读框,编码192aa,pI 9.72,Mw 19.6kDa,且序列中存在大量碱性氨基酸(Lys、Arg)。3个基因均在外套膜组织中特异性表达,且均在外套膜缘膜部上皮细胞中检测到了强烈的信号,推测3个基因都可能参与调控贝壳棱柱层以及珍珠层矿化。2.无核珍珠矿化可分为碳酸钙无序和有序沉积等两个阶段。在插片实验中,hichin在碳酸钙原始累积阶段出现高表达,推测hichin参与矿化过程中有机框架构建。Hic14和hic19的表达量在晶体有序沉积时显著性提高,推测hic14和hic19参与调控珍珠珍珠层生长形成过程。3.在RNA干扰实验中,注射dsRNA后外套膜荧光定量hichin、hic14、hic19和hic52四个基因表达量都出现明显下降,进行SEM观察后推测hichin与几丁质结合参与贝壳矿化过程中有机框架的构建,其他3个基质蛋白基因对棱柱层结构无明显影响,只对贝壳珍珠层矿化有影响,推测可能与珍珠层晶体生长、形貌有关。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

排列有序，形成的生物矿物与无机矿物相比具有显著差异。1.2 贝壳结构组成及形成过程1.2.1 贝壳结构软体动物贝壳是软体动物的外骨骼，同时也是最经典的生物矿物模型，保内部脆弱的内脏团[13]，贝壳、间液、外套膜、鳃、血淋巴等共同组成了软体物生物矿化系统[14]（见图 1-1），其中外套膜在生物矿化研究中处于核心地位正是由外套膜分泌的生物大分子在矿化位点控制的矿化产物的形成。通过解剖以发现外套膜由外到内主要可分为三个区域：边缘膜、膜部以及中央膜，并且缘膜又可分为外褶、中褶和内褶[15]，不同皱褶在矿化过程中所起作用也不尽同[16-18]。

1：hichin 的 mRNA 序列及其编码的氨基酸序列。斜体部分为信号肽，红色字体部分结构域 ChtBD2。该基因序列已提交到 GenBank（登录号 KY698014） 2-1：Nucleotide and deduced amino acid sequence of hichin. The putative signal peptideshown in Italic. The ChtBD2 is shown in red. The cDNA sequence has been submitted toGenBank (Accession KY698014).表 2-1：hichin 的氨基酸组成Table 2-1：Amino acid composition of hichinAmino acid Number Percent of totalamino acidsPro 15 8.3Cys 14 7.8Glu 14 7.8Ser 12 6.7Gly 11 6.1Val 11 6.1Ile 11 6.1Phe 10 5.6Thr 10 5.6

上海海洋大学硕士学位论文Arg 5 2.8Gln 5 2.8His 5 2.8Trp 2 1.1.2 蛋白二级及三级结构预测Phyre2 预测 hichin 蛋白二级结构（见图 2-2）由 4 个 α-螺旋和 7 个 β-折叠组成，其中占可预测结构的 37%，而 α-螺旋仅占 9%。三级结构（见图 2-3）与无脊椎动物几丁
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本文编号：2893885