川芎α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂基因（LASI）的克

发布时间：2020-12-04 18:23

　　川芎（Ligusticum chuanxiong Hort）为四川省著名的道地药材,具有祛风止痛、活血行气的功效,其指标成分为川芎嗪和阿魏酸,常用于治疗心脑血管、呼吸系统、泌尿系统等方面的疾病。目前已从多种植物中分离得到α-淀粉酶抑制剂,其在减肥、降血脂、治疗糖尿病和抗虫害等方面都有应用。本课题以川芎根茎转录组数据为基础,筛选出一条可能的α-淀粉酶抑制剂基因。采用RACE技术成功扩增出该基因的全长序列,命名为Ligusticumchuanxiongα-amylase Inhibitor （LASI）。基因序列上传至NCBIGenBank数据库,登录号为KX580040。对LASI蛋白的基本性质分析结果显示:LASI基因全长860bp,含612bp的CDS,编码203aa的蛋白质。其相对分子质量为22570Da,理论等电点为5.06,无明显的亲疏水性。LASI的1-23位氨基酸残基为信号肽,无跨膜结构域,亚细胞定位于胞外。通过与其他植物的α-淀粉酶抑制剂和胰蛋白酶抑制剂进行多序列比对后发现,LASI属于Kuntize型α-淀粉酶抑制剂,具有α-淀粉酶抑制剂和枯草杆菌蛋白酶抑制剂活性。LA... 

【文章来源】：西南交通大学四川省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 川芎简介
    1.2 川芎的药理作用
        1.2.1 对心脑血管的作用
        1.2.2 对神经系统的作用
        1.2.3 对呼吸系统的作用
        1.2.4 对泌尿系统的作用
        1.2.5 其他作用
    1.3 A-淀粉酶抑制剂
        1.3.1 非蛋白质类
        1.3.2 多肽类
        1.3.3 Lectin type
        1.3.4 Knottin type
        1.3.5 Cereal type
        1.3.6 Kuntize type
        1.3.7 γ-Purothionin type
        1.3.8 Thaumatin type
    1.4 A-淀粉酶抑制剂的功能和应用
        1.4.1 健康与疾病预防方面
        1.4.2 防治虫害方面
        1.4.3 对抗非生物胁迫方面
    1.5 课题的研究内容、意义和技术路线
        1.5.1 研究内容
        1.5.2 本研究的意义
        1.5.3 本课题的技术路线
第2章 川芎LASI基因的克隆及生物信息学分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株与载体
        2.1.3 其他试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 RNA的提取及cDNA的合成
        2.2.2 3'端RACE
        2.2.3 5'端RACE
        2.2.4 LASI的全长CDS克隆
    2.3 生物信息学分析
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 RNA提取
        2.4.2 3'端RACE和5'端RACE
        2.4.3 LASI全长CDS克隆
        2.4.4 理化性质分析
        2.4.5 亲/疏水性分析
        2.4.6 跨膜结构域分析
        2.4.7 信号肤分析
        2.4.8 亚细胞定位预测
        2.4.9 氨基酸序列比对分析
        2.4.10 分子进化树分析
        2.4.11 密码子偏好性分析
        2.4.12 二级结构预测
        2.4.13 功能结构域分析
        2.4.14 三级结构预测
        2.4.15 LASI初始模型的优化
    2.5 本章小结
第3章 LASI的原核表达与纯化
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌种与质粒
        3.1.2 试剂及材料
    3.2 实验方法
        3.2.1 LASI基因片段的制备
        3.2.2 原核表达载体的构建
        3.2.3 LASI的诱导表达
        3.2.4 原核表达条件的优化
        3.2.5 可溶性检测
        3.2.6 LASI蛋白的纯化
        3.2.7 纯化蛋白的鉴定
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 原核表达载体的构建
        3.3.2 LASI的诱导表达
        3.3.3 原核表达条件的优化
        3.3.4 可溶性检测
        3.3.5 LASI蛋白的纯化与鉴定
    3.4 本章小结
第4章 LASI的活性检测
    4.1 实验材料
        4.1.1 昆虫材料
        4.1.2 其他试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 LASI纯化蛋白浓度的测定
        4.2.2 昆虫淀粉酶的提取
        4.2.3 α-淀粉酶抑制活性检测
        4.2.4 枯草杆菌蛋白酶抑制活性检测
        4.2.5 胰蛋白酶抑制活性检测
        4.2.6 胰凝乳蛋白酶抑制活性检测
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 LASI纯化蛋白的浓度
        4.3.2 α-淀粉酶抑制活性
        4.3.3 蛋白酶抑制活性
    4.4 本章小结
第5章 LASI的表达模式分析
    5.1 实验材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 其他试剂
    5.2 实验方法
        5.2.1 川芎植物胁迫处理
        5.2.2 RNA的提取与cDNA的合成
        5.2.3 特异引物的检测
        5.2.4 RT-qPCR扩增
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 胁迫组织RNA提取
        5.3.2 特异性引物检测
        5.3.3 川芎LASI基因的表达模式分析
    5.4 本章小结
结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]HPLC测定不同采收期川芎药材中5种药效成分的含量[J]. 刘金亮,范巧佳,郑顺林,谭杰,周娟,袁继超,杨世民,孔凡磊.  中国中药杂志. 2014(09)
[2]中药川芎研究新进展[J]. 张晓琳,徐金娣,朱玲英,刘丽芳,李松林,徐宏喜.  中药材. 2012(10)
[3]川芎嗪、氨基胍对糖尿病大鼠肾脏组织非酶糖化和细胞凋亡的影响[J]. 明义,逄力男,刘海霞,刘长山,王秀军,孙丽萍.  中国现代药物应用. 2010(15)
[4]阿魏酸钠在肾脏疾病中的药理作用[J]. 王茹,张俊录.  中国煤炭工业医学杂志. 2010(03)
[5]川芎化学成分研究[J]. 郝淑娟,张振学,田洋,马跃平,彭勍,沈硕,张蕾,王金辉.  中国现代中药. 2010(03)
[6]川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑皮质Bcl-2表达的影响[J]. 李庚华,杨迎春,任占川.  解剖学杂志. 2010 (01)
[7]川芎水煎剂对小鼠神经功能的影响[J]. 阮琴.  浙江中医杂志. 2008(12)
[8]α-淀粉酶抑制剂的制备及检测[J]. 贾光锋.  食品与药品. 2007(02)
[9]川芎嗪对心脏骤停鼠脑复苏的作用[J]. 张慧利,余为治,黄亮.  江西医学院学报. 2006(06)
[10]川芎嗪对哮喘大鼠Th2型细胞因子作用的研究[J]. 金蕊,杨莉,陈径,李羚,唐珩.  现代医学. 2006(05)

硕士论文
[1]小麦α-淀粉酶抑制剂的药理药效研究[D]. 陈宁.南京工业大学 2006



本文编号：2898045