嗜酸乳杆菌NCFM沉默基因slpB的克隆表达及S-层蛋白结构与功能研究

发布时间：2020-12-11 03:15

　　嗜酸乳杆菌是乳酸菌中重要成员之一,在粘附宿主肠道细胞、与致病菌竞争粘附位点、调节机体免疫功能上发挥着重要作用。作为粘附因子的S-层蛋白,受到越来越多学者的关注与研究。随着基因工程技术的飞速发展,研究者从S-层蛋白的蛋白分子层面深入研究到了基因分子层面。研究表明嗜酸乳杆菌还有另外一个S-层蛋白基因slpB,与slpA基因不同的地方slpB属于沉默基因,对于基因slpB研究报道很少,对于其是否具有粘附功能还需要进一步探索。本课题的主要研究方法与结果如下:1、以提取的嗜酸乳杆菌全基因组为模板成功克隆出slpB基因,条带大小接近1300 bp,与NCBI报道L.acidophilus NCFM基因库中slpB基因大小一致。构建了重组质粒pET-28a-slpB,经过双酶切验证,得到约1300 bp的目的片段和约5400 bp的载体片段,与预测值相符。测序结果与NCBI数据库比对结果正确。2、对构建的重组质粒pET-28a-slpB进行了表达,确定了目的蛋白上清表达高于沉淀表达。通过控制变量法得到了最佳的诱导表达条件:诱导温度37℃、IPTG终浓度1mM、诱导时间14h。通过目的蛋白上的His-... 

【文章来源】：南京师范大学江苏省 211工程院校

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２．１?ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）质粒构型图??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｃｏｎｓｔｒｕｃ?

２．３实验结果与分析??２３．１办５基因的克隆??将提取的嗜酸乳杆菌全基因组进行琼脂糖凝胶电泳验证，见左图２．２Ａ。如图所??示，提取的ＤＮＡ条带单一，说明提取出的基因组片段较完整，无明显降解片段，可??进行后续基因扩增实验。??以提取的嗜酸乳杆菌ＮＣＦＭ全基因组为模板，Ｐｌ、Ｐ２为引物特异性扩增功？５基??因，如图２．２Ｂ所示，条带大小接近１３００?ｂｐ，与ＮＣＢＩ报道Ｌ?ｃｒｄｔ／ｏｐＭｗｓ?ＮＣＦＭ基因??库中基因大小一致。??１?Ｍ?Ｍｌ??Ｉ??１９３２９ｂｐ?ｉ????６２２３?ｂｐ??｜｜ＢＳ｜?１５００?ｂｐ????ｌｏｏｏ?ｔ＞ｐ?——??ａ?ｂ??图２．２全基因组ＤＮＡ与ＰＣＲ扩增结果??Ｆｉｇｕｒｅ?２．２?Ｔｏｔａｌ?ＤＮＡ?ｏｆ?ＮＣＦＭ?ａｎｄ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ??１９??

Ｍ：空载?ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）；?１：重组质粒?ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ??连接好的重组质粒经过转化、涂布、培养、蓝白斑筛选、菌落ＰＣＲ鉴定，最后??提取质粒如图２．４所示，重组质粒ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ条带明显高于空载??ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ；），可初步判定有基因片段己连接到Ｔ载体上，是否是目的片段还需??要相应的限制性内切酶进行酶切验证。??２．３．３重组质粒ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ双酶切验证??重组质粒ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ经Ｎｄｅｌ与Ｘｈｏｌ双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳检??测，如图２．５所示，重组质粒双酶切后得到大小约为１３００?ｂｐ的片段，与理论值相符，??说明重组质粒ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ构建成功。将小量酶切验证有目的基因条带的重??组质粒样品送至上海生工生物工程有限公司测序，测序结果与ＮＣＢＩ数据库进行比??对，如图２．６所示：扩增的１２９９?ｂｐ与数据库信息完全一致。将比对完全正确的重组??质粒进行保存。??１?Ｍ??Ｉ一?２０００?ｂｐ??＇—?１０００?ｂｐ??Ｉ??图２．５重组质粒ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ＞ｓｌｐＢ酶切验证??Ｆｉｇｕｒｅ?２．５?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＭＤ１９Ｔ（Ｓｉｍｐｌｅ）－ｓｌｐＢ?ｂｙ?ｒｅ


本文编号：2909806