嗜热木聚糖酶基因Umxyn10A在大肠杆菌中的重组表达及其热稳定性的改造

发布时间：2020-12-12 02:59

　　木聚糖是一种非均相聚合物,是半纤维素的主要成分之一。在过去的几十年里,作为生物质降解酶系中主要成员的木聚糖酶成为研究的热点,其在纺织品、食品、饲料、造纸以及医药等多个工业领域中都得到了广泛的应用。木聚糖酶主要作用于木聚糖的β-1,4-糖苷键,水解产生不同分子量的低聚木糖和木糖。目前,国内外已报道的克隆表达的木聚糖酶基因中大多数在高温下的热稳定性都比较差,不能满足工业生产需求,这也使木聚糖酶的应用受到了极大的限制。因此,对木聚糖酶的热稳定性的研究具有十分重要的意义。木聚糖酶Umxyn10A（Gen Bank序列号ABL73-883.1）是由本实验室前期从堆肥未培养微生物中筛选得到,属于GH 10家族。将木聚糖酶基因Umxyn10A去掉跨膜结构域的编码序列并进行密码子优化后,将其在大肠杆菌中进行表达,结果发现,木聚糖酶Umxyn10A最适反应温度为80℃,但热稳定性较差,当温度超过60℃时酶活力大幅度下降,其在65℃下的半衰期为15 min,在75℃下保温4 min就几乎失活。木聚糖酶 Umxyn 10A的最适pH为6.0,在pH 4.5～10.0范围能保持80%以上的酶活。该酶除了对木聚... 

【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校

【文章页数】：87 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－３木聚糖酶的空间结构１２８］??

图２－１?ＰＣＲ扩增突变酶基因的流程图??Ｆｉｇ．２－１?Ｆｌｏｗ?ｃｈａｒｔ?ｏｆ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｍｕｔａｎｔ?ｅｎｚｙｍｅ?ｇｅｎｅｓ??第一轮：以质粒ｐＥＴ３０ａ－Ｕｍｘｙｎｌ０Ａ为模板，ＹＳＸＬ－Ｆ，Ｔ１２１Ｅ－Ｌｅｆｉ－Ｒ分别为上下物，扩增出以突变位点为界的左片段（Ａ片段），以Ｔ１２１Ｅ－Ｒｉｇｈｔ－Ｆ，?ＹＳＸＬ－Ｒ分上下游引物扩增出右片段（Ｂ片段）。具体反应体系如下表２－４?（以扩增突变点Ｔ１２１Ａ片段为例）。对于突变位点靠近ＵｍｘｙｎｌＯＡ的Ｎ端或Ｃ末端（如Ａ２６Ｐ，Ｎ３１２Ｄ）突变位点，因需要扩增的片段太短，以ｐＥＴ３０ａ的前引物（Ｔ７）或后引物（Ｔ７ｔｅｒｍｉｎｎａｔｏ行片段扩增。ＰＣＲ反应条件，除退火温度、退火时间不同，其它条件和ＵｍｘｙｎｌＯ因的扩增保持一致。??

富?蛟诖蟪Ω司?械闹刈楸泶锛捌淙妊}定性的改造??据测定的结果绘制木糖标准曲线，如图２－３所示：??３．５?－?ｙ?＝?３．４０７８ｘ－０．０２０２??Ｒ２?＝?０．９９９??Ｉ１５＇??〇?２?Ｘ??１?Ｘ??。：：ｚ??０??１?１?．?１?１???０?０．２?０．４?０．６?０．８?１??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?（ｕｇ／ｍｌ）??图２－３木糖标准曲线??Ｆｉｇ．?２－３?Ｘｙｌｏｓｅ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ??２．木聚糖酶酶活的测定方法：酶活测定参照Ｍｉｌｌｅｒ！８１］的方法，用特定的缓冲液配制??１％木聚糖（ｂｅｅｃｈｗｏｏｄ?ｘｙｌａｎ）作为底物，取４５０?｜ｉｉＬ于２?ｍＬＥＰ管中（每组三个平行），??在最适温度下预热５?ｍｉｎ后，加入５０?ｐＬ适当稀释后的酶液（灭活后的酶液作为空白对??照），反应１０ｍｉｎ，反应结束后分别加入ｌｍＬ的ＤＮＳ终止反应。然后，将ＥＰ管架放??入沸水中，煮沸１０?ｍｉｎ，冷却至室温。最后吸取２００?ｐＬ的溶液到９６孔酶标板中，测定??其在５４０?ｎｍ下的吸光值。根据标准曲线计算出其酶活力。??２．２．６．４蛋白浓度标准曲线的制备??１．蛋白浓度标准曲线的制备方法如下：配制ｌｍｇ／ｍｌ的小牛血清蛋白（ＢＳＡ）标准??溶液，按表２－１０所示的量吸取各种溶液到ＥＰ管中并混合均匀，在室温放置５?ｍｉｎ，吸??取２００?ｐＬ的混合溶液到９６孔酶标板中，在５９５?ｎｍ处检测吸收光值，以蛋白浓度为横??坐标

【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
[1]宇佐美曲霉木聚糖酶AusXyn10A的克隆表达及耐热性的改造研究[D]. 汪俊卿.江南大学 2014
[2]蛋白质二硫键结构特征与序列关系的生物信息学研究[D]. 宋江宁.江南大学 2005

硕士论文
[1]通过N-端置换及定点突变提高木聚糖酶AoXyn11A耐热性的研究[D]. 何瑶.江南大学 2016



本文编号：2911726