利用CRISPR/Cas系统构建水稻OsGRF基因敲除株系

发布时间：2020-12-12 04:59

　　成簇规则相间的短回文重复（CRISPR/Cas）系统是近年新兴的一项RNA介导的核酸酶靶向基因编辑技术。本研究利用该系统对水稻中5个功能未知的OsGRF（Growth-Regulating Factor）基因家族成员（OsGRF3/7/8/9/11）进行定点突变试验,构建了基因敲除株系,并从突变效率、类型及它们的合子型3个方面对试验数据进行了比较分析。主要结果如下：1、突变效率。在5个靶基因OsGRF3/7/8/9/11的T0代中,敲除植株占总植株的比例分别是22/25、38/47、22/22、12/16和22/22,突变株频率在75.0—100.0%之间,体现了该技术对水稻基因定点敲除的高效性。实验中采用玉米ZmUbi的启动子驱动水稻密码子优化的Cas9蛋白的表达,同时由水稻OsU6启动子驱动gRNA的表达。推测可能正是这些核心组分的改造提高了靶向编辑的效率。2、突变类型。T0代靶标位点上绝大多数（约95%）发生≤3 bp的短片段缺失或插入突变,其中1 bp插入碱基组分多偏好于T和A（占89.3%）,说明Cas9/gRNA复合体造成的DNA双链断裂可能多由内源NHEJ途径介导易错修复... 

【文章来源】：福建农林大学福建省

【文章页数】：41 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
1 文献综述
    1.1 植物GRF基因家族
        1.1.1 拟南芥AtGRF家族的功能研究
        1.1.2 水稻OsGRF家族的研究进展
        1.1.3 GRF家族在其他植物中的研究
    1.2 CRISPR/Cas基因编辑系统
        1.2.1 CRISPR/Cas系统的发现及作用机理
        1.2.2 Cas9/gRNA系统的开发利用
        1.2.3 Cas9/gRNA系统在水稻中的应用和表达优化
2 材料与方法
    2.1 实验材料
    2.2 Cas9/gRNA敲除载体的构建
    2.3 转基因植株的检测与鉴定
3 结果与分析
    3.1 Cas9/gRNA敲除株系的构建及转基因检测
    3.2 各靶基因间的编辑效率比较
    3.3 靶点突变类型的比较
    3.4 突变合子型及后代分离检测
4 讨论
    4.1 突变效率的影响因素分析
    4.2 突变类型的比例分析
    4.3 突变合子型和遗传特性的初步分析
5 结论
参考文献
附录
    附录1 各靶基因的gRNA引物序列
    附录2 实验用的PCR引物
    附录3 SDS小量提取水稻叶片总DNA
致谢



本文编号：2911899