褐藻胶裂解酶产生菌的筛选及其基因的克隆表达

发布时间：2020-12-18 18:20

　　随着社会的快速发展,对生产生物能源的可再生资源的需求日益增加,国内外研究学者将目标放在了不占用耕地、可持续供应的海洋藻类上面。虽然理论上利用褐藻进行生物乙醇发酵是可行性,但进行工业化生产还难以实现,主要因为工业微生物菌株难以有效降解褐藻胶生成其可利用的单糖,因此寻求高效降解褐藻胶的裂解酶显得非常重要。本项研究旨在为褐藻胶的生物转化提供具有高酶活和广泛底物特异性的褐藻胶裂解酶,研究结果总结如下:（1）从腐烂海带中分离得到多株褐藻胶降解菌,通过透明圈定性及酶活力定量测定筛选出褐藻胶裂解酶酶活最高的菌株BH17,经16S rRNA序列比对及构建系统发育树,鉴定为解藻酸弧菌。对其进行生长特性和产酶条件的研究,发现该菌株最适产酶培养基为:0.6%海藻酸钠,0.6%磷酸氢二铵,0.2%磷酸氢二钾,4%氯化钠,0.1%七水硫酸镁。最适产酶pH为6.5-7.0,温度为20-25℃,发酵时间48 h。在以上优化条件下,每OD₆₂₀的酶活达到83 U/mL,优于目前已报道的多数菌株酶活。（2）采用Escherichia coli（E.coli）表达体系对褐藻胶裂解酶相关基因进行克隆表... 

【文章来源】：大连理工大学辽宁省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：86 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
    1.1 褐藻简介
        1.1.1 褐藻的特性
        1.1.2 褐藻的主要组成成分
    1.2 褐藻胶
        1.2.1 褐藻胶的结构和性质
        1.2.2 褐藻胶的降解方法
    1.3 褐藻胶寡糖的应用与前景
    1.4 褐藻胶裂解酶
        1.4.1 褐藻胶裂解酶的来源与分类
        1.4.2 褐藻胶裂解酶的结构
        1.4.3 褐藻胶裂解酶底物特异性及与结构的关系
        1.4.4 褐藻胶裂解酶活性检测方法
        1.4.5 褐藻胶裂解酶的功能与应用前景
    1.5 褐藻产生物乙醇的研究现状
    1.6 本课题的研究内容及研究意义
2 褐藻胶降解菌的筛选、鉴定及产酶条件优化
    2.1 引言
    2.2 材料
        2.2.1 主要实验仪器
        2.2.2 主要实验试剂
        2.2.3 培养基
    2.3 实验方法
        2.3.1 菌种来源
        2.3.2 褐藻胶降解菌的筛选
        2.3.3 菌种保藏
        2.3.4 菌株鉴定与分析
        2.3.5 产酶条件优化
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 褐藻胶降解菌的筛选与鉴定
        2.4.2 种子培养基菌株BH17的生长曲线
        2.4.3 培养基成分优化
        2.4.4 发酵条件的优化
    2.5 小结
3 褐藻胶裂解酶基因的克隆表达
    3.1 引言
    3.2 材料
        3.2.1 菌株和质粒
        3.2.2 培养基
        3.2.4 试剂
        3.2.5 主要实验仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 引物设计及序列比对
        3.3.2 质粒提取与E.coliDH5α感受态的制备
        3.3.3 PCR法扩增褐藻胶降解关键酶基因
        3.3.4 重组载体的构建及转化
        3.3.5 重组酶的表达及检测
        3.3.6 重组酶的酶活测定方法
        3.3.7 诱导条件的优化
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 褐藻胶裂解酶基因的克隆及表达载体的构建
        3.4.2 五株重组菌褐藻胶裂解酶的表达
        3.4.3 五株重组菌褐藻胶裂解酶的酶活测定
        3.4.4 rAlgV3诱导条件的优化
        3.4.5 BL21-AlgV3的高密度培养及诱导表达
    3.5 小结
4 褐藻胶裂解酶的分离纯化与酶学性质
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 主要试验仪器
        4.2.2 主要化学试剂
        4.2.3 培养基
    4.3 实验方法
        4.3.1 重力柱纯化重组酶
        4.3.2 重组酶rAlgV3酶活测定
        4.3.3 WesternBloting验证
        4.3.4 BCA法测定蛋白含量
        4.3.5 重组酶rAlgV3的酶学性质
        4.3.6 褐藻胶裂解酶降解产物ESI-MS分析
    4.4 结果与分析
        4.4.1 重组蛋白酶的分离纯化
        4.4.2 重组酶rAlgV3的最适温度和热稳定性
        4.4.3 重组酶rAlgV3的最适pH和pH稳定性
        4.4.4 不同离子对重组酶rAlgV3酶活的影响
        4.4.5 不同NaCl浓度对重组酶rAlgV3活性的影响
        4.4.6 重组酶rAlgV3底物偏好性分析
        4.4.7 褐藻胶裂解酶降解产物ESI-MS分析
    4.5 小结
结论
展望
参考文献
附录A BH17基因序列
附录B VMC35240基因及蛋白序列
附录C rAlgV3基因及蛋白序列
附录D 常用缓冲溶液的配制方法
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]“911”抗HBV作用的实验研究[J]. 姜宝法,徐晓菲,李笠,袁玮.  现代预防医学. 2003(04)



本文编号：2924390