利用CRISPR/Cas9技术定向突变水稻光温敏核不育基因PTGMS2-1的研究

发布时间：2020-12-20 04:28

　　水稻是世界上最重要的粮食作物之一,杂交稻的培育是提高水稻产量的重要方法,现如今最有效的方法是选育两用核不育系来配组杂交稻组合,但由于两用核不育系的选用受到多方面的限制,至今为止还没有一条特别有效的选育路径。CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术是继锌指核酸酶（ZFNs）、类转录因子效应物核酸酶（TALENs）和巨核酶技术的另一种基因编辑技术,它具有打靶效率高、周期短、载体结构简单等特点,为定向改良目标基因提供了一条非常有效的基因突变技术手段。随着水稻功能基因组研究的可喜进展,克隆了一批控制光温敏核不育性状的基因,为开展基因定向突变打好了非常好的基础。本研究选择水稻隐性光温敏不育基因PTGMS2-1利用CRISPR/Cas9技术进行定向突变来获得水稻光温敏核不育系,开展了如下研究并获得如下结果:1、构建了CRISPR/Cas9定向突变载体:通过分析PTGMS2-1基因序列,在外显子上选出以A开头NGG结尾和G开头NGG结尾的20个碱基的目标序列,其中以A开头的目标序列与含有U3启动子的双元载体相连,以G开头的目标序列与含有U6启动子的双元载体相连。利用大肠杆菌的转化方法筛选出目标载体,... 

【文章来源】：江西农业大学江西省

【文章页数】：53 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 光温敏不育系的研究进展
        1.1 光照和温度对两用核不育系育性的影响
        1.2 光温敏核不育系的分类
        1.3 两用核不育系选育的途径与方法
        1.4 两用核不育系基因的定位与克隆
        1.5 两用核不育系选育存在的问题
    2 CRISPR/Cas9介导基因组编辑技术的研究进展
        2.1 CRISPR/Cas系统的基本结构
        2.2 CRISPR/Cas系统的防御机制
        2.3 CRISPR/Cas系统的发现与类型
        2.4 CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑
        2.5 CRISPR/Cas9系统在植物中的研究进展
        2.6 CRISPR/Cas9系统面临的挑战和未来的发展
    3 本研究的目的和意义
第二章 实验材料与方法
    1 实验材料
    2 主要的试剂及引物
        2.1 主要的试剂
        2.2 主要的引物序列
    3 载体的构建
        3.1 目标序列的设计
        3.2 连接反应
        3.3 大肠杆菌转化
        3.4 单克隆菌种的挑取与保存
        3.5 质粒的提取及检测
        3.6 酶切反应体系
        3.7 农杆菌转化
    4 CRISPR/Cas9的载体遗传转化
        4.1 粤泰B愈伤组织的诱导
        4.2 共培养菌液的制备
        4.3 共培养和共培养后愈伤的筛选
        4.4 愈伤组织的分化培养
    5 转基因植株的检测
        5.1 转基因植株的PCR检测
        5.2 HMR检测方法
第三章 结果与分析
    1 载体的构建
        1.1 目标序列的设计
        1.2 大肠杆菌的转化与质粒的测序
        1.3 载体完整性的验证
    2 转基因植株的植物组织培养
    3 转基因植株的检测
        3.1 PCR检测转基因植株
0代植株靶基因敲除位点初步检测">        3.2 T₀代植株靶基因敲除位点初步检测
第四章 结论与讨论
    1 讨论
        1.1 CRISPR/Cas9系统对PTGMS2-1 基因定向突变的效果
        1.2 传统的两系不育系的育种方式与CRISPR/Cas9系统介导基因突变的育种方式的优劣
        1.3 下一步研究计划
    2 结论
参考文献
致谢
附录 主要试剂配方


【参考文献】：
期刊论文
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[2]光温敏核不育水稻的研究进展[J]. 陈云风.  宜春学院学报. 2010(08)
[3]水稻两用核不育系的育性光温效应及遗传机理[J]. 刘海,陈立云.  作物研究. 2008(S1)
[4]水稻两用核不育系研究进展[J]. 杨烨,陈立云.  作物研究. 2008(S1)
[5]水稻两用核不育系C815S的选育与利用[J]. 唐文邦,陈立云,肖应辉,刘国华,邓化冰.  湖南农业大学学报(自然科学版). 2007(S1)
[6]应用花培技术选育优质低温敏水稻核不育系金山S-1[J]. 陈志伟,林荔辉,周元昌,潘润森,毛大梅,吴建梅,官华忠.  江西农业大学学报. 2005(05)
[7]温度对两系杂交水稻育性恢复的影响[J]. 谢国生,曾汉来,林兴华,陶爱林,张端品.  遗传学报. 2003(02)
[8]两用核不育水稻的选育与利用研究进展[J]. 廖亦龙,王丰,李传国,李曙光,柳武革,刘振荣,黄德娟.  作物研究. 2002(S1)
[9]中籼型优质光温敏核不育系广占63S的选育[J]. 杨振玉,张国良,张从合,陈金节,王合勤,张金家,严志.  杂交水稻. 2002(04)
[10]实用早籼型两用核不育系选育策略与进展[J]. 杨远柱,唐平徕,符辰建,严革连.  作物研究. 2002(02)



本文编号：2927206