牛支原体pdhα和pdhβ基因的克

发布时间：2021-01-02 08:04

　　牛支原体（Mycoplasma bovis,M.b）是牛（Bos taurus）的一种重要致病性支原体,感染后可引起牛多种疾病。丙酮酸脱氢酶复合体E1（pyruvate dehydrogenase E1,PDHc E1）是参与生物体糖代谢过程的一个限速酶,广泛存在于微生物、哺乳动物及高等植物中,其直接影响丙酮酸向乙酰辅酶A的转化。本研究参照Gen Bank中M.b PG45株的PDHc E1α亚基基因pdhα和PDHc E1β亚基基因pdhβ序列设计引物,通过PCR扩增获得M.b武威株的pdhα（Gen Bank登录号:KU355295）及pdhβ基因（Gen Bank登录号:KU355296）,在序列测定的基础上应用重叠延伸PCR（Overlap PCR）技术完成基因优化并构建原核表达质粒p ET-pdhα和p ET-pdhβ。表达质粒分别转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）后经异丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达重组PDHc E1α亚基融合蛋白PDHA及PDHc E1β亚基蛋白... 

【文章来源】：农业生物技术学报. 2016年04期 北大核心

【文章页数】：9 页

【部分图文】：

1α和E1β亚基在牛支原体细胞膜和细胞质中分布

亚细胞定位鉴定相类似，故定位于牛支原体细胞膜的E1α和E1β亚基是否具有与其他支原体及病原菌外向酶相似的生物学功能，如粘附、入侵、免疫逃逸、图9E1α和E1β亚基在牛支原体细胞膜和细胞质中分布的ELISA分析Figure9ELISAanalysisofdistributionofE1αandE1βsubunitsinthemembraneandcytoplasmfromM.b空白Blankcontrolα-亚基抗血清Anti-PDHAβ-亚基抗血清Anti-PDHB00.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50膜蛋白Membraneprotein胞浆蛋白CytosolproteinDO504图7重组融合蛋白rPDHA和rPDHB的SDS-PAGE分析Figure7SDS-PAGEanalysisofrecombinantproteinsrPDHAandrPDHBM：预染蛋白分子质量标准；1：pET-pdhα表达菌超声裂解沉淀；2：pET-pdhα表达菌超声裂解上清；3：rPDHA纯化产物；4：pET-pdhβ表达菌超声裂解沉淀；5：pET-pdhβ表达菌超声裂解上清；6：rPDHB纯化产物；7：pET-28a(+)转化的表达菌。M:Prestainedproteinladder;1:Lyticprecipitationofexpres-sionproductsfrompET-pdhα;2:Lyticsupernatantofexpres-sionproductsfrompET-pdhα;3:PurifiedrPDHA;4:Lyticpre-cipitationofexpressionproductsfrompET-pdhβ;5:Lyticsu-pernatantofexpressionproductsfrompET-pdhβ;6:PurifiedrPDHB;7:NegativecontrolM12345675341302218149kD4037kD图8E1α和E1β亚基在牛支原体细胞膜和细胞质中分布的Westernblot分析Figure8WesternblotanalysisofdistributionofE1αandE1βsubunitsinthemembraneandcytoplasmfromM.bM：预染蛋白分子标准；A1：rPDHA；B1：rPDHB；A2、B2：全菌蛋白；A3、B3：疏水性蛋白；A4、B4：亲水性蛋白M:Prestainedproteinladder;A1

ㄎ煌ǔ？煞治??饷浮??内酶及共价键连接在细胞表面的外向酶等，而外向酶的功能是目前细菌学研究的热点。Thomas等(2013)等对肺炎支原体的研究表明，肺炎支原体E1β是一种血纤维蛋白溶酶原结合相关蛋白，并且E1β被递呈在肺炎支原体的细胞膜上；而Dallo等(2002)证明肺炎支原体的E1β同样被转运至细胞膜表面，并结合纤连蛋白进行感染。这与本研究的亚细胞定位鉴定相类似，故定位于牛支原体细胞膜的E1α和E1β亚基是否具有与其他支原体及病原菌外向酶相似的生物学功能，如粘附、入侵、免疫逃逸、图9E1α和E1β亚基在牛支原体细胞膜和细胞质中分布的ELISA分析Figure9ELISAanalysisofdistributionofE1αandE1βsubunitsinthemembraneandcytoplasmfromM.b空白Blankcontrolα-亚基抗血清Anti-PDHAβ-亚基抗血清Anti-PDHB00.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50膜蛋白Membraneprotein胞浆蛋白CytosolproteinDO504图7重组融合蛋白rPDHA和rPDHB的SDS-PAGE分析Figure7SDS-PAGEanalysisofrecombinantproteinsrPDHAandrPDHBM：预染蛋白分子质量标准；1：pET-pdhα表达菌超声裂解沉淀；2：pET-pdhα表达菌超声裂解上清；3：rPDHA纯化产物；4：pET-pdhβ表达菌超声裂解沉淀；5：pET-pdhβ表达菌超声裂解上清；6：rPDHB纯化产物；7：pET-28a(+)转化的表达菌。M:Prestainedproteinladder;1:Lyticprecipitationofexpres-sionproductsfrompET-pdhα;2:Lyticsupernatantofexpres-sionproductsfrompET-pdhα;3:PurifiedrPDHA;4:Lyticpre-cipitationofexpressionproductsfrompET-pdhβ;5:Lyticsu-pernatantofexpressionproductsfrompET-pdhβ;6:PurifiedrPDHB;7:NegativecontrolM

【参考文献】：
期刊论文
[1]绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae）丙酮酸脱氢酶E1-α亚单位基因（pdha）的克隆、表达及其免疫学活性测定[J]. 许健,储岳峰,高鹏程,赵萍,贺英,剡根强,逯忠新.  农业生物技术学报. 2012(03)
[2]国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体[J]. 辛九庆,李媛,郭丹,宋念华,胡守萍,陈超,裴洁,曹培丽.  中国预防兽医学报. 2008(09)



本文编号：2952982