大豆HMGR基因家族的克
发布时间：2021-01-06 04:16
大豆（Glycine max（Linn.）Merr.）是我国重要的粮食经济作物,大豆皂苷是大豆中一类重要的次生代谢产物,对植物生命活动具有重要作用,在保健品和化工产业具有巨大的市场潜力。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）是大豆皂苷合成代谢途径上游的第一个关键酶,且以基因家族的形式存在,决定着最终大豆皂苷合成的含量。因此,研究大豆HMGR基因家族对于深入探究大豆皂苷合成代谢机制具有重要意义。本研究以武乡小黑豆为供试材料,克隆大豆HMGR关键酶基因家族,并对其进行生物信息学分析。采用荧光定量PCR技术对武乡小黑豆及晋遗30苗期根、茎、叶不同组织及籽粒不同发育时期中HMGR基因的表达量进行了检测分析,进而在HMGR基因转录水平上揭示该基因家族的分子调控机制。将8个GmHMGR基因分别转进了INVScⅠ酿酒酵母,利用半乳糖诱导进行过表达,在不同浓度的H2O2和NaCl胁迫条件下,观察转基因酵母的生长状况,分析其抗氧化和抗盐能力,初步探究大豆HMGR基因家族的功能。主要研究结果如下:1.克隆分离得到8个GmHMGR基因。cDNA全长为42...
【文章来源】： 刁秀楠 山西农业大学
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
pEASY-Blunt载体图谱
122.2.9测序将提取的重组质粒送往上海生工生物股份有限公司，利用通用引物M13F/M13R测序，得到测序正确的基因序列。2.2.10GmHMGR基因家族生物信息学分析利用MG2C2.0（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）绘制染色体定位图。理化性质利用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）来预测，SOPMA（http://bip.weizmann.ac.il/biotools/faq.html）进行二级结构分析。Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html）分析其三级结构。利用Clustalw程序对GmHMGR基因编码蛋白的氨基酸序列进行多序列比对，用MEGA5.0软件利用邻接法（Neighbor-Joiningalgorithm）构建系统进化树。MEME（http://memesuite.org/）分析保守结构域，GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析基因结构，用TMHMM-2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行跨膜螺旋结构预测。WoLFPSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）进行亚细胞定位。SignalP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）对蛋白进行信号肽预测。PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行启动子分析。2.3结果与分析2.3.1总RNA的提取由图2-2可知，所提大豆总RNA电泳时，位于4.6~5.3kb的28SrRNA和1.8~2.0kb的18SrRNA条带清晰完整，且亮度达到2:1，泳道无拖尾现象，说明所提武黑的总RNA完整性较好。使用核酸蛋白检测仪检测浓度及纯度，A260/A280值为2.0以上，A260/A230值为2.0以上，说明所提RNA纯度较高，可用于后续实验。图2-2武黑苗期不同组织总RNA电泳图Fig.2-2ElectrophoresisoftotalRNAofdifferenttissuesatseedlingstageinWuhei注：M:Trans1KMark；1：根；2：茎；3：叶。Note:M:Trans1KMark;1:Root;2:Stem;3:Leaf.
132.3.2基因的克隆及测序由于本实验室前期已克隆出1个GmHMGR基因，将其命名为GmHMGR1。将鉴定的其余7个GmHMGR基因家族的成员，根据GmHMGR基因基因家族各成员序列特异性设计基因特异引物并进行PCR扩增，克隆测序得到了全部的基因序列，结果如图2-3、图2-4、表2-6。GmHMGR1~GmHMGR8基因cDNA全长分别为1842bp、426bp、1976bp、2069bp、1990bp、2135bp、1825bp、1861bp，开放阅读框长度分别为1632bp、243bp、1668bp、1782bp、1827bp、1764bp、1671bp、1698bp，分别编码543、80、555、593、608、587、556、565个氨基酸。该基因家族的克隆产物将被用于后续的表达载体构建和功能验证。图2-3GmHMGR基因克隆电泳图Fig.2-3ElectrophoresisofclonedGmHMGRgenes注：M:Trans5KMark；1~8分别为GmHMGR1~GmHMGR8。Note:M:Trans5KMark;1~8areGmHMGR1~GmHMGR8.表2-6GmHMGR基因的克隆片段Table2-6ClonedsequenceofGmHMGRgenes基因名称Genename基因IDGeneID基因全长Genelength(bp)5"-非翻译区5"-UTR(bp)3"-非翻译区3"-UTR(bp)开放阅读框ORF(bp)编码蛋白长度Proteinslength(aa)GmHMGR1XM_003517069.41842801301632543GmHMGR2XM_014775260.24261325124380GmHMGR3XM_003537651.31976362721668555GmHMGR4XM_003534178.420691081791782593GmHMGR5XM_006605513.31990126371827608GmHMGR6XM_003547838.421352701011764587GmHMGR7XM_003519426.4182558961671556GmHMGR8XM_003545508.4186191721698565
本文编号：2959914
【文章来源】： 刁秀楠 山西农业大学
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122.2.9测序将提取的重组质粒送往上海生工生物股份有限公司，利用通用引物M13F/M13R测序，得到测序正确的基因序列。2.2.10GmHMGR基因家族生物信息学分析利用MG2C2.0（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）绘制染色体定位图。理化性质利用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）来预测，SOPMA（http://bip.weizmann.ac.il/biotools/faq.html）进行二级结构分析。Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html）分析其三级结构。利用Clustalw程序对GmHMGR基因编码蛋白的氨基酸序列进行多序列比对，用MEGA5.0软件利用邻接法（Neighbor-Joiningalgorithm）构建系统进化树。MEME（http://memesuite.org/）分析保守结构域，GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析基因结构，用TMHMM-2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行跨膜螺旋结构预测。WoLFPSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）进行亚细胞定位。SignalP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）对蛋白进行信号肽预测。PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行启动子分析。2.3结果与分析2.3.1总RNA的提取由图2-2可知，所提大豆总RNA电泳时，位于4.6~5.3kb的28SrRNA和1.8~2.0kb的18SrRNA条带清晰完整，且亮度达到2:1，泳道无拖尾现象，说明所提武黑的总RNA完整性较好。使用核酸蛋白检测仪检测浓度及纯度，A260/A280值为2.0以上，A260/A230值为2.0以上，说明所提RNA纯度较高，可用于后续实验。图2-2武黑苗期不同组织总RNA电泳图Fig.2-2ElectrophoresisoftotalRNAofdifferenttissuesatseedlingstageinWuhei注：M:Trans1KMark；1：根；2：茎；3：叶。Note:M:Trans1KMark;1:Root;2:Stem;3:Leaf.
132.3.2基因的克隆及测序由于本实验室前期已克隆出1个GmHMGR基因，将其命名为GmHMGR1。将鉴定的其余7个GmHMGR基因家族的成员，根据GmHMGR基因基因家族各成员序列特异性设计基因特异引物并进行PCR扩增，克隆测序得到了全部的基因序列，结果如图2-3、图2-4、表2-6。GmHMGR1~GmHMGR8基因cDNA全长分别为1842bp、426bp、1976bp、2069bp、1990bp、2135bp、1825bp、1861bp，开放阅读框长度分别为1632bp、243bp、1668bp、1782bp、1827bp、1764bp、1671bp、1698bp，分别编码543、80、555、593、608、587、556、565个氨基酸。该基因家族的克隆产物将被用于后续的表达载体构建和功能验证。图2-3GmHMGR基因克隆电泳图Fig.2-3ElectrophoresisofclonedGmHMGRgenes注：M:Trans5KMark；1~8分别为GmHMGR1~GmHMGR8。Note:M:Trans5KMark;1~8areGmHMGR1~GmHMGR8.表2-6GmHMGR基因的克隆片段Table2-6ClonedsequenceofGmHMGRgenes基因名称Genename基因IDGeneID基因全长Genelength(bp)5"-非翻译区5"-UTR(bp)3"-非翻译区3"-UTR(bp)开放阅读框ORF(bp)编码蛋白长度Proteinslength(aa)GmHMGR1XM_003517069.41842801301632543GmHMGR2XM_014775260.24261325124380GmHMGR3XM_003537651.31976362721668555GmHMGR4XM_003534178.420691081791782593GmHMGR5XM_006605513.31990126371827608GmHMGR6XM_003547838.421352701011764587GmHMGR7XM_003519426.4182558961671556GmHMGR8XM_003545508.4186191721698565
本文编号：2959914
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