免疫接头蛋白Skap1和Fyb双基因敲除小鼠模型的建立及SKAP1相互作用蛋白的鉴定
发布时间：2021-01-13 09:09
接头蛋白是一类缺乏转录活性和酶活性的分子,但其含有对蛋白质结合和构成信号复合物所需的蛋白质间互作的结构域。SKAP1和FYB1是一对主要在T细胞和免疫细胞中表达的功能相关的接头蛋白,并且FYN-SKAP1分子模块在“inside-out”信号通路中作为整合素激活的调控因子来介导T细胞粘附。FYB1结合并维持SKAP1的表达,在细胞系和动物模型中,FYB1的敲除会导致SKAP1蛋白的显著性降解。在由整合素激活而引起的T细胞粘附中FYB1和SKAP1的功能性存在很大的重叠性,Fyb和Skap1单基因敲除的小鼠已经产生并广泛应用于研究,Fyb和Skap1双基因敲除小鼠有利于对FYB-SKAP1分子模块在TCR介导的整合素激活进行功能性评估,但Fyb和Skap1双基因敲除小鼠还未有报导。本研究的主要目标是利用Fyb和Skap1单基因敲除的小鼠进行一系列的交配,最终培育出Skap1和Fyb的双基因敲除小鼠模型。此外,为鉴定与SKAP1互作的分子,使用免疫共沉淀法得到Jurkat细胞中与SKAP1结合的蛋白,再使用液相色谱串联质谱法进行分析。结果:获得了基因型能稳定遗传的Fyb和Skap1双基因敲...
【文章来源】：浙江农林大学浙江省
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
人FYB1蛋白的结构域及特殊位点Figure1.1ThedomainsandspecialaminoacidsitesofhumanFYB1protein
SKAP1 的蛋白大小为 55 kDa，SKAP1 蛋白存在两个变体，变体 1 编码 359 个氨基酸，变体 2 编码 358 个氨基酸，虽相差 1 个氨基酸但两个变体均具有相同的氨基端与羧基端。人 SKAP1 蛋白结构域示意图如下（图 1.2），氨基端区域含有一个特殊的PH 结构域（aa107-210），羧基端有一个 SH3 结构域（aa294-355）[42]，共有五个能被磷酸化的酪氨酸位点，分别为 aa142，aa219，aa232，aa271，aa295，其中 aa271 和aa295 的酪氨酸位点能被 FYN 蛋白磷酸化，aa232 的酪氨酸位点能被 PTPRC 蛋白（Protein tyrosine phosphatase, receptor type, C）磷酸化[43]。SKAP1 蛋白的 290 位到 295位氨基酸与 FYB1 蛋白发生结合，SKAP1 蛋白的 aa271 被 FYN 蛋白磷酸化是 SKAP1蛋白与 Grb2 蛋白结合的先决条件[44]，当 aa295 被 FYN 磷酸化后会使 SKAP1 与 FYB1的结合功能丧失[41, 45]。在未被激活 T 细胞中，SKAP1 蛋白 120 位的天冬氨酸可使SKAP1 蛋白滞留在细胞质中，而 TCR 被激活后，SKAP1 蛋白 152 位的赖氨酸能通过结合肌动蛋白（actin）来促进 SKAP1 细胞膜招募的功能[46]。SKAP1 蛋白的 D120 与K152 均位于 PH 结构域内，PH 结构域与肌动蛋白的结合依赖于 K152，且该结合能促进裸蛋白（talin）与 LFA-1 的结合，最终使 LFA-1 被激活[46]。
图 2.1 Fyb 和 Skap1 双基因敲除小鼠的配种Figure 2.1 The breeding of Fyb and Skap1 double knockout mice小鼠基因表达的鉴定 小鼠脾脏细胞的获取. 左手拇指与大拇指按住小鼠颈椎处，右手拉住小鼠尾巴，拉断小鼠颈椎，鼠浸泡于 70 %的乙醇消毒 10 min。. 沥干小鼠，并将小鼠的四肢固定于解剖板，腹部朝上。用镊子提起腹中线殖器的皮肤，用剪刀沿腹中线由尾部向头部剪开皮肤，不要剪破腹膜，再按剪开皮肤，并固定皮肤，暴露腹腔的左部。. 准备好一个 6 cm 的细胞培养皿，70 μm 的细胞滤网，将细胞滤网置于细胞。. 换一副新的镊子和剪刀，剪开腹膜，用镊子夹起胃并提起，即可看到呈深条状的脾脏。将脾脏取出并放于事先准备好的细胞滤网中，向脾脏加 3 m. 用研磨器研磨脾脏至肉眼不可见块状的组织，将细胞滤网置于 50 ml 离心
本文编号：2974620
【文章来源】：浙江农林大学浙江省
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
人FYB1蛋白的结构域及特殊位点Figure1.1ThedomainsandspecialaminoacidsitesofhumanFYB1protein
SKAP1 的蛋白大小为 55 kDa，SKAP1 蛋白存在两个变体，变体 1 编码 359 个氨基酸，变体 2 编码 358 个氨基酸，虽相差 1 个氨基酸但两个变体均具有相同的氨基端与羧基端。人 SKAP1 蛋白结构域示意图如下（图 1.2），氨基端区域含有一个特殊的PH 结构域（aa107-210），羧基端有一个 SH3 结构域（aa294-355）[42]，共有五个能被磷酸化的酪氨酸位点，分别为 aa142，aa219，aa232，aa271，aa295，其中 aa271 和aa295 的酪氨酸位点能被 FYN 蛋白磷酸化，aa232 的酪氨酸位点能被 PTPRC 蛋白（Protein tyrosine phosphatase, receptor type, C）磷酸化[43]。SKAP1 蛋白的 290 位到 295位氨基酸与 FYB1 蛋白发生结合，SKAP1 蛋白的 aa271 被 FYN 蛋白磷酸化是 SKAP1蛋白与 Grb2 蛋白结合的先决条件[44]，当 aa295 被 FYN 磷酸化后会使 SKAP1 与 FYB1的结合功能丧失[41, 45]。在未被激活 T 细胞中，SKAP1 蛋白 120 位的天冬氨酸可使SKAP1 蛋白滞留在细胞质中，而 TCR 被激活后，SKAP1 蛋白 152 位的赖氨酸能通过结合肌动蛋白（actin）来促进 SKAP1 细胞膜招募的功能[46]。SKAP1 蛋白的 D120 与K152 均位于 PH 结构域内，PH 结构域与肌动蛋白的结合依赖于 K152，且该结合能促进裸蛋白（talin）与 LFA-1 的结合，最终使 LFA-1 被激活[46]。
图 2.1 Fyb 和 Skap1 双基因敲除小鼠的配种Figure 2.1 The breeding of Fyb and Skap1 double knockout mice小鼠基因表达的鉴定 小鼠脾脏细胞的获取. 左手拇指与大拇指按住小鼠颈椎处，右手拉住小鼠尾巴，拉断小鼠颈椎，鼠浸泡于 70 %的乙醇消毒 10 min。. 沥干小鼠，并将小鼠的四肢固定于解剖板，腹部朝上。用镊子提起腹中线殖器的皮肤，用剪刀沿腹中线由尾部向头部剪开皮肤，不要剪破腹膜，再按剪开皮肤，并固定皮肤，暴露腹腔的左部。. 准备好一个 6 cm 的细胞培养皿，70 μm 的细胞滤网，将细胞滤网置于细胞。. 换一副新的镊子和剪刀，剪开腹膜，用镊子夹起胃并提起，即可看到呈深条状的脾脏。将脾脏取出并放于事先准备好的细胞滤网中，向脾脏加 3 m. 用研磨器研磨脾脏至肉眼不可见块状的组织，将细胞滤网置于 50 ml 离心
本文编号：2974620
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