转基因玉米MON863质粒DNA双重数字PCR定值方法的建立

发布时间：2021-01-15 10:06

　　针对转基因玉米MON863质粒DNA,研究建立一套双重数字PCR（ddPCR）定值方法。优化引物探针浓度,退火温度等条件,考察方法特异性、线性范围、精密度。结果表明,外源基因MON863在1.6～6 743.3 copies和内源基因Adh在1.1～6 770.0 copies的浓度范围均呈线性关系,r²为1;MON863基因和Adh基因的定量限分别为8.3 copies和7.9 copies;方法精密度小于5%。采用该方法对基体标准物质进行验证,误差小于10%。该方法每个反应体系都含有内源（VIC）和外源（FAM）基因,能实现内外源基因的同时检测,避免同一样品在不同反应体系造成的定值差异。结果显示该方法与单重数字PCR定值结果无显著差异,重复性优于单重数字PCR结果,方法准确可靠。 

【文章来源】：中国测试. 2020,46(10)北大核心

【文章页数】：9 页

【部分图文】：

引物探针终浓度优化微滴图

设计8个退火温度：62,61.2,59.8,57.7,55.2,53.1,51.8,51℃，每个温度3次平行试验。经考察，退火温度为60℃（59.8℃）时，copies合适，没有明显的“下雨”现象（见图3),RSD较小（见表2）。退火温度为61.2℃时，copies虽高但有不稳定扩增，且RSD值较高，因此，本研究选择60℃（59.8℃）为最适退火温度具体结果如表2、图3和图4所示，图4中从左到右温度依次为：62,61.2,59.8,57.7,55.2,53.1,51.8,51℃（每个温度下设置3个重复）。实验结果表明，内源基因Adh正反向引物终浓度400 nmol/L，探针终浓度为250 nmol/L；外源基因MON863正反向引物终浓度250 nmol/L，探针终浓度为150 nmol/L；退火温度为60℃时，微滴生成数达到要求，没有明显的“下雨”现象，方法重复性好，稳定性佳。

试验表明，采用单重和双重数字PCR方法，测得的待测质粒DNA目标copies无显著差异（Adh (偏差=-0.5%)和MON863 (偏差=-5.7%)）。测得的MON863含量无显著差异（偏差=-4.7%）（见表3）。此外，双重数字PCR测定MON863含量的重复性优于单重数字PCR法。经考察，本研究建立的双重数字PCR法与单重数字PCR法定值结果无显著差异。2.3 定量限、检出限、线性范围验证

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：2978713