Cathepsin b基因在斑马鱼早期胚胎发育中作用的研究

发布时间：2021-01-18 17:04

　　半胱氨酸组织蛋白酶cathepsin B主要存在于溶酶体中,是一种嗜酸性蛋白酶,能够水解胞内破损细胞器和蛋白质等,并且能够随小泡分泌到细胞外降解胞外基质中组分。斑马鱼中cathepsinb基因存在两种基因亚型,cathepsinba（ctsba）和 cathepsin bb（ctsbb）。本论文利用CRISPR/Cas9技术敲除了斑马鱼cathepsinba基因,并在子一代筛选获得cathepsinba杂合突变体。通过ctsbba杂合突变体互交获得子二代,部分胚胎在50%下包期胚胎发育出现停滞,其中一部分死亡,死亡数占全部胚胎的6.9%左右。另一部分胚胎在停滞约1-2h后恢复迟缓的发育,在咽囔期出现明显的形态畸形,包括心包囊肿、尾部折叠和弯曲等,发育至2-3天后死亡,这部分胚胎占全部胚胎数量的19.3%,经基因鉴定结果显示这些死亡胚胎均为纯合突变体。胚胎死亡率大概占全部胚胎数量的四分之一,符合孟德尔遗传定律,说明ctsba基因存在隐性致死效应。RT-PCR检测ctsba-/-突变体中发生非编码的mRNA降解（nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD）,说明ctssa... 

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图１．哺乳动物体内半胱氨酸组织蛋白酶形成与运输路线图［１３］??溶酶体半胱氨酸组织蛋白酶作为溶酶体酶中重要蛋白酶之一，在细胞内外参??

均具有的肽链端解酶活性之外，同时也具有肽链内切酶活性［５］。Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ?Ｂ在??人体中的蛋白质晶体结构图示首先被破解，组织蛋白酶Ｂ作为一个单体蛋白其??结构如图２所示［３０］。人体中组织蛋白酶Ｂ前体蛋白其蛋白结构包括３３９个氨基??酸：Ｎ末端为１７个氨基酸残基及其后连接６２个氨基酸残基的前肽部分，中间由??含２５４个氣基酸残基的成熟ｃａｔｈｅｐｓｉｎ?Ｂ蛋白组成，而在Ｃ末端则包含６个氨基??酸残基的延伸部分［３１］。在组织蛋白酶前体蛋白中，前肽以一种与底物相反的方向??存在于活性位点沟槽中，这种排列方式恰好阻止了该蛋白在近中性ｐＨ比如粗面内质??网和高尔基体中起到裂解作用［３２］。与其他组织蛋白酶相比，组织蛋白酶Ｂ广泛??存在于动物的各个组织与器官中，且在细胞外环境中该酶的稳定性远高于其他同??种酶［３３－３５］。??暴??＊７?ＡＳＮ??图２．?ｃａｔｈｅｐｓｉｎ?Ｂ蛋白结构示意图［３０］??４??

山东大学硕士学位论文５?６７?Ｓ９?１０??Ｈ?Ｈ?ＩＡＴＧＣＣＡＡＡＧＴＧＡ６ＴＧＴＧＧＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＧＧＴＴＴＣＡＣＴＣＡＣＡＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＣ图３．?ｃ姑《基因敲除粑位点设计??体构建??的制备??Ｂｂｓｌ酶切ｐＴ７－ｇＲＮＡ质粒，切胶回ｇＲＮＡ－ＢｂｓＩ（图?４）。??


本文编号：2985315