白念珠菌HOF1基因高表达菌株的构建及其功能鉴定

发布时间：2021-01-18 17:25

　　目的 :构建白念珠菌HOF1基因高表达菌株,探索HOF1基因高表达对细胞应答遗传毒性试剂胁迫和调控形态发生的作用。方法:采用瞬时CRISPR/Cas9系统,分别于体外扩增Cas9基因、单链向导RNA（single-guide RNA,sgRNA）以及带MET3启动子的修复DNA（repair DNA）片段,转化白念珠菌野生型菌株SN148,于SD-Ura-Met-Cys选择培养基筛选转化子,通过菌落聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）验证基因型,以构建HOF1基因高表达菌株;利用平板表型实验检测HOF1高表达对遗传毒性试剂胁迫的表型,通过4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）染色结合荧光显微镜等观察细胞形态。结果 :PCR检测发现HOF1基因自身启动子被MET3启动子成功替换后,通过检测引物能扩增出约3.2 kb的单一条带;HOF1基因高表达导致细胞对遗传毒性试剂甲基磺酸甲酯（methyl methanesulfonate, MMS）和羟基脲（hydroxyurea, HU）敏感... 

【文章来源】：南通大学学报(医学版). 2020,40(05)

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

HOF1高表达菌株的构建

前期研究[5]发现，HOF1主要参与胞质分裂过程，但其缺失导致细胞对遗传毒性试剂MMS等敏感。本实验进一步检测了HOF1高表达对细胞应答遗传毒性试剂的影响：发现HOF1高表达也导致细胞对0.01%MMS和30 mmol/L HU表现出一定的敏感性表型(图2)，预示HOF1基因在DNA损伤应答中发挥关键作用。此外还发现，HOF1高表达不明显影响细胞对紫外线(ultraviolet,UV)胁迫(90 J/m2)的应答表型。2.3 HOF1高表达促进细胞分裂

本研究主要通过CRISPR/Cas9方法构建了HOF1的高表达菌株。白念珠菌为双倍体细胞，其遗传操作相对困难，使用传统方法需要利用两个不同的筛选标记对两个等位基因依次替换/编辑，过程费时且成功率较低，严重阻碍了白念珠菌基因功能研究的开展。随着CRIPSR/Cas9系统的发现以及在白念珠菌中的应用，大大提高了基因编辑的效率[10]。而且，本研究中采用了近期新发明的瞬时CRISPR/Cas9系统[11]，该系统通过体外PCR扩增基因编辑所涉及的Cas9和sg RNA等组分，免去了基因的克隆等步骤，进一步简化了实验流程，如本研究中通过一次转化得到的纯合子高表达菌株比例超过40%，值得大力推广使用。DNA损伤应答与白念珠菌形态发生的联系是白念珠菌形态转换研究的一个新热点。本课题组前期研究[5]发现，HOF1参与检验点激酶Rad53相关的DNA损伤应答，但其具体机制尚不明了。推测Hof1可作为一种直接的DNA损伤应答调控相关蛋白，因其缺失影响了Rad53相关的损伤应答信号传递以及DNA损伤的修复，导致对MMS等遗传毒性试剂敏感；此外，Hof1也可能间接地参与DNA损伤应答，其缺失导致胞质分裂过程缺陷，进而影响了基因组的稳定性，表现为对遗传毒性试剂敏感。本研究通过构建HOF1高表达菌株，发现HOF1的高表达可以促进胞质分裂，且有较多体积较小细胞出现，提示细胞的非正常分裂最终可能影响细胞对遗传毒性试剂的应答。综合前期的研究成果，推测HOF1可能主要间接参与DNA损伤应答，其缺失或高表达都影响了细胞周期的正常进程，进而影响细胞对遗传毒性试剂正确应答。

【参考文献】：
期刊论文
[1]利用CRISPR/Cas9系统快速构建白念珠菌RAD23高表达菌株的研究[J]. 冯佳,胡婧,单爱迪,曹振宇,吕睿,冯金荣.  中国病原生物学杂志. 2019(09)



本文编号：2985344