Bt-Cry5Aa杀虫基因的原核表达、纯化及其在棉花中的鉴定

发布时间：2021-01-20 00:55

　　单一转苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）基因Cry1Ab/Cry1Ac抗虫棉（Gossypium）作为我国生产上大面积种植作物,随着种植时间及面积的增加导致害虫对Bt毒蛋白的抗性增强迫使新型Bt基因研究工作成为解决问题的关键。Cry5Aa是一种具有兼抗鳞翅目和线虫的新型Bt杀虫基因,由湖南农业大学棉花研究所成功转入棉花,并获得稳定遗传的’JX0010’、’JX0020’品系,本研究构建了Cry5Aa全长基因原核表达载体,优化了原核表达诱导条件,并且对其在转Bt-Cry5Aa基因棉花品系中的表达进行了鉴定。结果表明,在37℃220 r/min 1.0 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside, IPTG）条件下诱导4 h,其蛋白表达量最高。通过Western blot分析,发现蛋白分子量为79 kD,与理论值一致;同时,该蛋白以包涵体形式存在,通过谷胱甘肽-Sepharose4B小颗粒亲和层析纯化,蛋白纯度可达95%以上;转Bt-Cry5Aa基因棉花品系的鉴定实验表明:Cry5... 

【文章来源】：农业生物技术学报. 2020,28(09)北大核心

【文章页数】：9 页

【部分图文】：

Bt-Cry5Aa质粒图谱

不同时间1.0 mmol/L IPTG浓度诱导、表达

采用带有限制性内切酶Bam HⅠ、SaIⅠ酶切位点的引物，Bam HⅠ、SaIⅠ酶切消化、回收pGEX-4T-3载体和Cry5Aa目的基因片段，把pGEX-4T-3表达载体和Cry5Aa目的片段相连接，转化至感受态细胞BL21 (DE3)。进行初步PCR阳性克隆质粒(图3)鉴定在LB固体平板(含Amp)上挑取的过夜培养的6个单菌落。然后扩培初步鉴定的3个阳性质粒菌液，提取得到质粒；进一步鉴定阳性重组载体采用Bam HⅠ、SaIⅠ双酶切。有3个阳性重组载体酶切(图4)在琼脂糖凝胶电泳显示后，在5 000和2 000 bp处出现特异性片段，其中在5 000 bp处出现的特异性片段与pGEX-4T-3 (4968 bp)空载体相接近，在2 000 bp处出现的特异性片段则与Cry5Aa目的基因片段(2097 bp)相接近，表明pGEX-4T-3+Cry5Aa (+)表达载体的构建成功，而且经过测序后此结果得到了进一步确认。图3 重组pGEX-4T-3+Cry5Aa (+)质粒初步PCR鉴定

【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
[1]转Bt抗虫棉对非靶标昆虫的安全性评价[D]. 牛林.华中农业大学 2017



本文编号：2988034