棉铃虫ABCC2和Cadherin基因变异品系的构建及其对Bt抗性的研究
发布时间：2021-01-20 00:36
靶标害虫抗性的产生是制约转Bt作物长期有效种植的重要因素之一,害虫抗性演化机制的研究是Bt研究方向中的一个热点。田间抗性演化机制较为复杂,同一昆虫个体内可能同时出现两个及以上基因的变异,然而大多数的研究着重于单个基因变异的Bt抗性,有关两个及以上基因共变异的Bt抗性研究甚少。本研究通过体外细胞试验、变异品系的构建、生物测定和生命表制作等多种方法对ABCC2、Cadherin基因单独变异以及共变异介导的Bt抗性进行了研究,并检测了田间棉铃虫种群ABCC2和Cadherin基因变异频率,主要研究结果如下:1、棉铃虫ABCC2基因体外细胞试验结果显示,该基因表达的蛋白定位在细胞膜上,转入该基因的体外昆虫细胞在低浓度Cry1Ac处理下就出现细胞裂解,其EC50（使50%的转染细胞裂解的Cry1Ac浓度）为0.109μg/mL。生测结果显示,构建的棉铃虫ABCC2基因变异近等基因系（LFC2）对Cry1Ac的抗性倍数为512倍。LFC2在抗虫棉33B（Cry1Ac表达量为274.06±27.05 ng/g）上的死亡率为27.33±5.00%,显著低于敏感品系的死亡率（46....
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：95 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
996-2017年全球转基因作物种植情况（ISAAA,2017）
6图 1.2 靶标害虫 Bt 抗性机制示意图（Xiao and Wu, 2019）Fig. 1.2 Bt resistance mechanisms in target pests (Xiao and Wu, 2019)此外，2018 年，Jin 等发现 tetraspanin 基因点突变与田间棉铃虫种群 Bt 抗性有关，基因编辑该突变位点，可以使抗性品系恢复对 Bt 的敏感性，在敏感个体中定点插入该变异可以产生 125 倍的抗性。检测发现 2006 年，该基因在田间的变异频率为 0.001，到 2016 上升为 0.10，10 年内增加了 10倍（Jin et al., 2018a）。1.3 Bt 抗性适合度代价适合度是指一种生物能够在生态环境中生存下来，并能将自身的遗传物质传递给后代的能力，主要包括生长发育能力和交配繁殖能力。生态环境需要保持平衡，所以其中的每一个生物要得以生存，必然也要有其自身的平衡能力，在某一方面能力的提高往往会导致另一方面能力降低。已有多项研究表明，昆虫对 Bt 的抗性演化会影响其适合度，即 Bt 抗性适合度代价，导致抗性昆虫个体死亡率升高、生长发育缓慢或繁殖能力降低（Groeters et al., 1994; Oppert et al., 2000; Akhurst et al2003），从而减慢抗性演化速度。范贤林等研究发现抗性倍数为 20 倍的棉铃虫抗性种群，与敏感对照品系相比，在生长发育方面
图 2.1 廊坊系列品系的筛选培育Fig. 2.1 Slection of LF Bt resistance strains棉铃虫ABCC2基因编辑品系CASC2由中国农科院深圳基因组所的萧玉涛研究员和靳明辉博士提供（Jin et al., 2018），该品系在 Cry1Ac 浓度为 5.0 μg/mL 的人工饲料上饲养。所有的品系置于温度为 26 ± 1°C，湿度为 60 ± 1%，光周期为 16 L : 8 D 的养虫室内，幼虫用含有玉米面和黄豆面的人工饲料饲养，成虫置于养虫笼中，饲喂 10%的糖水，供其补充营养，养虫笼上方覆盖医用纱布供其产卵。每 24 h 更换一次卵布，然后将卵布置于 250 mL 的玻璃或塑料杯中。2.1.2 体外细胞试验1、PCR 反应及转化克隆载体以棉铃虫 cDNA 为模板进行 PCR，扩增 ABCC2 和 Cadherin 基因全长。PCR 反应体系如下：ddH20 18.5 μL10×Ex Taq Buffer 2.5 μLdNTP Mixture(2.5 mM) 1.5 μL
本文编号：2988003
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：95 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
996-2017年全球转基因作物种植情况（ISAAA,2017）
6图 1.2 靶标害虫 Bt 抗性机制示意图（Xiao and Wu, 2019）Fig. 1.2 Bt resistance mechanisms in target pests (Xiao and Wu, 2019)此外，2018 年，Jin 等发现 tetraspanin 基因点突变与田间棉铃虫种群 Bt 抗性有关，基因编辑该突变位点，可以使抗性品系恢复对 Bt 的敏感性，在敏感个体中定点插入该变异可以产生 125 倍的抗性。检测发现 2006 年，该基因在田间的变异频率为 0.001，到 2016 上升为 0.10，10 年内增加了 10倍（Jin et al., 2018a）。1.3 Bt 抗性适合度代价适合度是指一种生物能够在生态环境中生存下来，并能将自身的遗传物质传递给后代的能力，主要包括生长发育能力和交配繁殖能力。生态环境需要保持平衡，所以其中的每一个生物要得以生存，必然也要有其自身的平衡能力，在某一方面能力的提高往往会导致另一方面能力降低。已有多项研究表明，昆虫对 Bt 的抗性演化会影响其适合度，即 Bt 抗性适合度代价，导致抗性昆虫个体死亡率升高、生长发育缓慢或繁殖能力降低（Groeters et al., 1994; Oppert et al., 2000; Akhurst et al2003），从而减慢抗性演化速度。范贤林等研究发现抗性倍数为 20 倍的棉铃虫抗性种群，与敏感对照品系相比，在生长发育方面
图 2.1 廊坊系列品系的筛选培育Fig. 2.1 Slection of LF Bt resistance strains棉铃虫ABCC2基因编辑品系CASC2由中国农科院深圳基因组所的萧玉涛研究员和靳明辉博士提供（Jin et al., 2018），该品系在 Cry1Ac 浓度为 5.0 μg/mL 的人工饲料上饲养。所有的品系置于温度为 26 ± 1°C，湿度为 60 ± 1%，光周期为 16 L : 8 D 的养虫室内，幼虫用含有玉米面和黄豆面的人工饲料饲养，成虫置于养虫笼中，饲喂 10%的糖水，供其补充营养，养虫笼上方覆盖医用纱布供其产卵。每 24 h 更换一次卵布，然后将卵布置于 250 mL 的玻璃或塑料杯中。2.1.2 体外细胞试验1、PCR 反应及转化克隆载体以棉铃虫 cDNA 为模板进行 PCR，扩增 ABCC2 和 Cadherin 基因全长。PCR 反应体系如下：ddH20 18.5 μL10×Ex Taq Buffer 2.5 μLdNTP Mixture(2.5 mM) 1.5 μL
本文编号：2988003
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