绿色木霉内切葡聚糖酶Ⅶ基因的克隆与表达

发布时间：2021-01-24 04:50

　　纤维素是地球上最丰富,潜力巨大的可再生资源,微生物降解纤维素是纤维素有效利用的一种绿色环保的方法。而绿色木霉（Trichoderma viride）可以产生纤维素酶来降解纤维素。本研究以绿色木霉（T.viride）AS3.3711菌株为实验材料,根据GenBank数据库上登录号为EU518927的T.viride AS3.3711的eg VII基因序列来设计引物,通过DNA和RNA为模板进行PCR,得到的序列经过比对得出内切葡聚糖酶VII基因没有内含子,基因长度782 bp,开放阅读框750 bp,编码249个氨基酸,理论分子量26.8002 KD,理论等电点7.62,信号肽是N端的19个氨基酸,属于糖苷水解酶家族61的一种胞外酶。为高效表达内切葡聚糖酶,将克隆到的eg VII基因连接到表达载体pPIC9K上,获得重组质粒pPIC9K-α1-eg VII,pPIC9K-α2-eg VII和pPIC9K-α3-eg VII。将重组质粒用电转化法转入巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115菌株中,测定内切葡聚糖酶酶活后,发现pPIC9K-05的酶活力最高。甲醇诱导酵母转化... 

【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

木质纤维素的框架

图 1-2 纤维素复合酶的水解机制Fig. 1-2 Hydrolysis mechanism of cellulose complex enzymes系含有的内切葡聚糖酶是纤维素降解的主要成分，它的主要作用是水[15]，在纤维素降解中至关重要。其酶活力会受到温度、pH、激活剂和生产中的内切葡聚糖酶多为具有较高的耐热、耐酸碱性的酶，Posta葡聚糖酶，为我们提供了具有耐热性的纤维素酶。糖酶通常由纤维素结合区域（Cellulose-binding module，CBM），main，CD）和一段富含脯氨酸或羟基氨酸的连接桥（linker）三部分组素表面并将 CD 暴露在底物之上，此时 CD 呈现出对底物的特异性，疏解结晶纤维素的结构[18]。达系统研究概况大肠杆菌已经大范围充当重组蛋白表达宿主。由于这种简单的微生物修饰的机制，所以该系统在表达真核蛋白质上存在问题。因此，蛋白叠以及重组蛋白的功能特征都影响到能否在大肠杆菌中成功表达。无进行进一步的翻译后修饰限制了蛋白质表达[19]。由于在大肠杆菌中缺

图 2-1 pPIC9K 质粒图谱Fig. 2-1 pPIC9K plasmid profilesEcoRI，BglII，T4DNA 连接酶，小量提取试剂盒，Trizol 试剂， Tris-HCl（pH 8.0），1 mM EDTpH 8.0）：溶解 121.1 g Tris 于 80压灭菌。（Tris 溶液的 pH 值因温ol/L 溶液在 5℃，25℃和 37℃时的H 8.0）：将 186.1 g EDTA-Na·2H.0，定容至 1 L，分装后高压灭菌


本文编号：2996605