整合型CRISPR/Cas9系统构建白念珠菌MTQ2基因缺失株及其表型分析

发布时间：2021-01-28 02:36

　　目的构建白念珠菌MTQ2基因缺失株,并检测该基因缺失对细胞生长及遗传毒性试剂耐受性的影响。方法采用整合型CRISPR/Cas9系统,将sgRNA克隆到pV1093质粒中,线性化后与含HIS1基因的修复DNA一起通过醋酸锂法转化白念珠菌野生型菌株SN148,于SD+NAT-His培养基筛选转化子,通过PCR验证基因型,利用平板表型试验检测MTQ2缺失对细胞生长及遗传毒性试剂耐受性的影响。结果成功构建了MTQ2纯合子缺失菌株。MTQ2缺失导致串珠样细胞比例（44.4%）较野生型菌株（2.5%）显著增加,细胞增殖能力变弱,生长缺陷明显。结论利用整合型CRISPR/Cas9系统构建了白念珠菌MTQ2纯合子缺失菌株,且发现MTQ2基因可能参与维持细胞的增殖。 

【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2020,15(09)北大核心

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

白念珠菌和酿酒酵母Mtq2氨基酸序列比对

采用整合型CRISPR/Cas9系统[13]构建MTQ2缺失株。将融合的sgRNA片段克隆到pV1093质粒的BsmBⅠ位点(图2-A),EcoRⅠ酶切验证阳性克隆切出约7.2 kb、4.4 kb和2.5 kb的条带,与理论值大小相符(图-2B,1号和2号泳道)。将测序验证阳性质粒命名为pV1093-sgMTQ2。以pFA-HA-HIS1质粒为模版,利用引物MTQ2-Re-F和MTQ2-Re-R扩增获得带有HIS1标记的修复DNA片段大小约1.5 kb,与理论值相符(图-2C)。将转化后的转化子提取基因组DNA,利用PCR的方法进行基因型验证(图3A)。通过MTQ2-Te-F和MTQ2-Te-R,在野生型菌株SN148中扩出约1.1 kb的片段;而在双敲除菌株中以扩出约2 kb的片段(图3B),MTQ2缺失株中能扩出单一的约2 kb片段,说明MTQ2基因敲除成功。

进一步检测液体培养基中MTQ2缺失株的生长情况,结果如图4C。液体培养基中MTQ2缺失株细胞形态与野生型菌株SN148相比无显著差异,但MTQ2缺失株中较多细胞黏连成串珠状。定量分析显示MTQ2缺失株中3个及以上串珠状细胞占总细胞数的44.4%,野生型菌株为2.5%,说明MTQ2缺失影响细胞的分裂过程。图4 白念珠菌MTQ2缺失株的表型分析


本文编号：3004201