黄瓜耐低氮胁迫相关基因CsGS1的功能分析

发布时间：2021-01-28 18:40

　　氮素是植物生命活动中的限制元素,是核酸、蛋白质等生物大分子的基本组分。目前,在农业生产中往往为追求高产而过量施用氮肥,使成本提高,收益降低,且对环境造成严重的负面影响。黄瓜是大量需氮的园艺作物,尽管在其生长发育过程中大量施用氮肥,但氮素利用效率较低,仍不能从根本上解决黄瓜的氮素需求,培育耐低氮黄瓜品种才是解决这一问题的根本途径。本研究以分析黄瓜氮代谢相关基因CsGS1在低氮胁迫下的功能为目的,利用实时荧光定量PCR分析CsGS1在低氮条件下的表达模式;通过构建GFP荧光蛋白融合表达载体对CsGS1蛋白进行亚细胞定位;利用子叶侵染法分别将构建的正义CsGS1表达载体和反义CsGS1表达载体转化到黄瓜耐低氮品种“D0328”和不耐低氮品种“D0422”中,并测定转基因植株与耐低氮胁迫有关的生理生化指标,分析CsGS1在黄瓜低氮胁迫中的作用,为培育耐低氮型黄瓜品种提供理论基础。本文获得的主要研究结果如下:1.不同氮素浓度处理下,CsGS1组织特异性表达分析结果表明:在低氮（3 mM）条件下,CsGS1在耐低氮品种“D0328”叶片中表达量最高,显著高于根1.84倍,高于茎1.98倍;CsGS... 

【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 研究的目的与意义
    1.2 国内外研究进展
        1.2.1 植物氮代谢的研究进展
        1.2.2 GS基因家族
    1.3 研究内容及技术路线
        1.3.1 主要研究内容
        1.3.2 试验技术路线
2 材料与方法
    2.1 试验材料
    2.2 不同氮浓度处理
    2.3 RNA的提取与检测
    2.4 cDNA第1 链的合成
    2.5 CsGS1 的克隆
        2.5.1 CsGS1 PCR扩增产物的回收
        2.5.2 CsGS1 连接克隆载体与阳性筛选
    2.6 CsGS1 的生物信息学分析
    2.7 CsGS1 表达模式分析
    2.8 CsGS1 亚细胞定位分析
        2.8.1 植物绿色荧光表达载体的构建
        2.8.2 质粒的纯化
        2.8.3 拟南芥原生质体细胞的制备
        2.8.4 CsGS1-GFP质粒转化拟南芥原生质体
    2.9 CsGS1 对黄瓜的遗传转化
        2.9.1 试验材料与培养基
        2.9.2 遗传转化载体的构建
        2.9.3 黄瓜遗传转化实验方法
    2.10 转基因阳性植株功能验证
        2.10.1 光合参数的测定
        2.10.2 叶绿素b含量的测定
        2.10.3 总氮量的测定
        2.10.4 GS酶活性的测定
        2.10.5 植株鲜重、株高和根长的测定
3 结果与分析
    3.1 CsGS1 的克隆
        3.1.1 黄瓜植株总RNA的检测
        3.1.2 CsGS1 的全长及酶切验证
    3.2 生物信息学分析
        3.2.1 蛋白质理化性质分析
        3.2.2 蛋白质信号肽预测
        3.2.3 CsGS1 蛋白跨膜区域预测
        3.2.4 CsGS1 蛋白质亲水性与疏水性预测
        3.2.5 CsGS1 蛋白的高级结构预测
        3.2.6 CsGS1 蛋白系统进化分析
    3.3 低氮处理条件下CsGS1 在黄瓜不同器官中的表达分析
    3.4 CsGS1 亚细胞定位
        3.4.1 植物绿色荧光表达载体的构建
        3.4.2 CsGS1 在拟南芥原生质体的定位
    3.5 CsGS1 植物表达载体构建
    3.6 黄瓜遗传转化
        3.6.1 草甘膦抗性筛选
        3.6.2 CsGS1 转基因黄瓜植株的获得
    3.7 转基因黄瓜抗性植株的PCR鉴定
    3.8 转基因植株功能验证
        3.8.1 光合参数的测定
        3.8.2 叶绿素b含量的测定
        3.8.3 总氮量的测定
        3.8.4 植物鲜重、株高和根长的测定
        3.8.5 谷氨酰胺合成酶（GS）活性的测定
4 讨论
    4.1 GS1 在植物氮代谢中的作用
    4.2 不同氮素条件下CsGS1 的表达模式
    4.3 GS1 的细胞亚定位与其作用的关系
    4.4 CsGS1 的过表达可增强黄瓜耐低氮能力
    4.5 展望
    4.6 本研究的创新与不足
        4.6.1 本研究的创新之处
        4.6.2 本研究的不足之处
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]分光光度法测定叶绿素含量的提取液的适宜浓度[J]. 胡秉芬,黄华梨,季元祖,赵晓芳,戚建莉,张露荷,张广忠.  草业科学. 2018(08)
[2]减量施氮对玉米/大豆套作系统中作物氮素吸收及土壤氨氧化与反硝化细菌多样性的影响[J]. 周丽,付智丹,杜青,陈平,杨文钰,雍太文.  中国农业科学. 2017(06)
[3]中国粮食生产中化肥过量施用评价及影响因素研究[J]. 史常亮,郭焱,朱俊峰.  农业现代化研究. 2016(04)
[4]霜霉威胁迫下黄瓜CsWRKY30表达及功能分析[J]. 李胜男,秦智伟,辛明,周秀艳.  中国农业科学. 2016(07)
[5]具有除草剂抗性的TA克隆植物表达载体的构建[J]. 李梦婷,谭文雍,孙铭阳,李永光,李文滨.  基因组学与应用生物学. 2015(11)
[6]低氮条件下黄瓜寡肽转运蛋白（OPT）基因的克隆及表达分析[J]. 何红梅,秦智伟,冯卓,武涛,辛明,周秀艳.  分子植物育种. 2013(05)
[7]黄瓜细胞质型谷氨酰胺合成酶基因（GS1）的克隆及其在低氮条件下的表达[J]. 冯卓,秦智伟,武涛,何红梅.  中国农业科学. 2012(15)
[8]耐低氮胁迫黄瓜品种的筛选[J]. 姜爽,吴凤芝,关颂娜,于敏锐.  中国蔬菜. 2012(08)
[9]黄瓜耐低氮基因型的筛选及遗传分析[J]. 于明磊,秦智伟,徐静静,周秀艳.  中国蔬菜. 2011(12)
[10]植物生长调节剂对大豆氮代谢相关生理指标以及产量和品质的影响[J]. 郑殿峰,宋春艳.  大豆科学. 2011(01)

博士论文
[1]基于农学效应和环境效益的华北平原主要粮食作物合理施氮量确定方法研究[D]. 张亦涛.中国农业科学院 2018
[2]黄瓜低霜霉威残留性相关基因CsDIR16的鉴定及功能分析[D]. 刘春红.东北农业大学 2017

硕士论文
[1]黄瓜耐低氮胁迫生理及分子机制初步研究[D]. 范莲雪.东北农业大学 2016
[2]黄瓜CDPK基因的克隆及遗传转化[D]. 何红梅.东北农业大学 2013
[3]低氮胁迫下黄瓜幼苗差异表达基因鉴定与蛋白质组学分析[D]. 冯卓.东北农业大学 2012
[4]黄瓜耐低氮性特征特性研究[D]. 徐静静.东北农业大学 2011



本文编号：3005486