CRISPR/Cas9系统介导的棉花GhCLA1和GhVP基因编辑的研究
发布时间：2021-01-29 13:56
棉花作为一种自然纤维、植物蛋白和食用油的重要来源,具有非常重要的经济和社会价值。现在异源四倍体棉花的种植最为广泛,其基因组大而复杂的特点给棉花基因和基因组功能的研究提出了挑战,但科学家一直在探索和发明新的生物技术去更为有效和精准地研究棉花的基因功能。CRISPR/Cas9系统作为一种最新的基因组编辑技术,由于具有简单、高效、灵活、低廉的优点,自从出现以来就被广泛应用于多种物种的基因组编辑研究。本研究利用CRISPR/Cas9系统对陆地棉GhCLA1和GhVP基因进行了定点突变,分别在棉花子叶原生质体和转基因植株中检测了该系统对两个基因的编辑情况,还在转基因植株中检测了CRISPR/Cas9系统的脱靶情况。针对棉花构建了棉花特异性的CRISPR/Cas9系统表达载体,初步在棉花子叶原生质体中对GhVP基因进行了定点突变研究,同时也利用Cas9-sgRNA蛋白（RNP）复合体对GhVP基因在体外和体内的编辑效果进行了初步研究。主要结果如下:1.利用半定量PCR对棉花GhCLA1和GhVP基因的表达情况进行检测,发现两个基因的表达均比较活跃,可以作为基因编辑的靶标。针对GhCLA1和GhVP...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：82 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
农杆菌介导的棉花茎尖遗传转化
图 3.1 GhCLA1 和 GhVP 基因表达水平的 RT-PCR 检测Fig. 3.1 Detection of expression levels of GhCLA1 and GhVP gene 3.2 GhCLA1 和 GhVP 基因 sgRNA 的设计为了简化后续实验操作，利于采用 RE-PCR 的方法验证靶标序列首先将得到的两个基因的所有 sgRNA 进行酶切位点分析，挑选 PAM合适酶切位点的 sgRNA 用于下一步的筛选。由于在线软件 CRISPR-有雷蒙德氏棉的基因组序列数据，所以将上一步得到的 sgRNA 在陆地数据库中进行相似性比对，每个基因筛选特异性最强的 5 个 sgRNA 作序列（表 3.1）。对 GhCLA1 和 GhVP 基因的 5 个sgRNA 分别经在棉花子叶原生质编辑的功能鉴定，结果发现 GhCLA1-sgRNA5 和 GhVP-sgRNA4 对靶
和 PAM 序列在相应亚基因组上的序列是完全一致的。表 3.1 GhCLA1 和 GhVP 基因的靶标位点序列Table 3.1 Target sites of GhCLA1 and GhVP gene基因 命名 靶标位点序列及 PAM 序列 酶切位点GhCLA1 sgRNA1 AGTTCAACCACAATCTCTGCAGG PstIsgRNA2 CCTAGACGTCTTCGACGGACATT PstIsgRNA3 TGGTGTGGTTGAACTCACTGTGG TspRIsgRNA4 CATGCTGTCACCTTTGCTGCAGG PstIsgRNA5 GGTGATGGTGCTATGACTGCAGG PstIGhVP sgRNA1 CCGGTGTGTCCGAGCATGCAAGG SphIsgRNA2 TTTATTGTTGCGTTTAGATCTGG BglIIsgRNA3 CTCGTTGGTGCAGTGGGTGATGG BstIsgRNA4 TCAGTTCTTTCTGGATTCCTTGG HinfIsgRNA5 TAACATTCTTATCAAGCTTATGG HindIII
【参考文献】：
期刊论文
[1]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao. Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
本文编号：3007002
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：82 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
农杆菌介导的棉花茎尖遗传转化
图 3.1 GhCLA1 和 GhVP 基因表达水平的 RT-PCR 检测Fig. 3.1 Detection of expression levels of GhCLA1 and GhVP gene 3.2 GhCLA1 和 GhVP 基因 sgRNA 的设计为了简化后续实验操作，利于采用 RE-PCR 的方法验证靶标序列首先将得到的两个基因的所有 sgRNA 进行酶切位点分析，挑选 PAM合适酶切位点的 sgRNA 用于下一步的筛选。由于在线软件 CRISPR-有雷蒙德氏棉的基因组序列数据，所以将上一步得到的 sgRNA 在陆地数据库中进行相似性比对，每个基因筛选特异性最强的 5 个 sgRNA 作序列（表 3.1）。对 GhCLA1 和 GhVP 基因的 5 个sgRNA 分别经在棉花子叶原生质编辑的功能鉴定，结果发现 GhCLA1-sgRNA5 和 GhVP-sgRNA4 对靶
和 PAM 序列在相应亚基因组上的序列是完全一致的。表 3.1 GhCLA1 和 GhVP 基因的靶标位点序列Table 3.1 Target sites of GhCLA1 and GhVP gene基因 命名 靶标位点序列及 PAM 序列 酶切位点GhCLA1 sgRNA1 AGTTCAACCACAATCTCTGCAGG PstIsgRNA2 CCTAGACGTCTTCGACGGACATT PstIsgRNA3 TGGTGTGGTTGAACTCACTGTGG TspRIsgRNA4 CATGCTGTCACCTTTGCTGCAGG PstIsgRNA5 GGTGATGGTGCTATGACTGCAGG PstIGhVP sgRNA1 CCGGTGTGTCCGAGCATGCAAGG SphIsgRNA2 TTTATTGTTGCGTTTAGATCTGG BglIIsgRNA3 CTCGTTGGTGCAGTGGGTGATGG BstIsgRNA4 TCAGTTCTTTCTGGATTCCTTGG HinfIsgRNA5 TAACATTCTTATCAAGCTTATGG HindIII
【参考文献】：
期刊论文
[1]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao. Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
本文编号：3007002
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3007002.html
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