基于CRISPR/Cas9系统高通量筛选研究功能基因

发布时间：2021-01-30 08:23

　　利用功能缺失型（Loss-of-function）或者功能获得型（Gain-of-function）策略高通量筛选功能基因,是研究人员快速寻找调控特定表型的重要或关键基因的主要方法。RNA干扰（RNA interference,RNAi）的遗传筛选方法因操作简单、成本相对较低等优势,尽管已经得到了广泛的应用,然而其抑制效果不完全、脱靶效应明显等劣势依然存在。近年来兴起的CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9）技术能快速、简便、准确地实现基因组敲除等编辑功能,因而成为一种强大的遗传筛选工具;在各种细胞系、人和小鼠及斑马鱼等多种模式动物中,大规模运用该方法筛选功能基因已经取得了巨大成功。本文总结了CRISPR/Cas9技术的特点,将其与传统基因工程方法进行了分析比较,回顾了近期相关的高通量功能基因筛选工作,最后探讨了该技术未来的发展趋势。 

【文章来源】：遗传. 2016,38(05)北大核心

【文章页数】：11 页

【部分图文】：

Cas9、sgRNA与DNA相互作用示意图

抵薪?辛?筛眩首先他们在单倍体细胞系KBM7中以对6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine，嘌呤类似物)细胞致死作用的抗性为表型，筛选了参与DNA错配修复通路(Mismatchrepair，MMR)的基因。MMR-proficient(pMMR，WT)细胞将无法修复6-硫代鸟嘌呤引发的细胞损害而停留在G2-M的细胞周期节点，而MMR-defective(dMMR，mutation)细胞将不识别错配而继续分裂。研究者们向Cas9-KBM7细胞系中转染了整个sgRNA文库，在浓度足以致死WTKBM76-硫代鸟嘌呤条件下培养，然后对存活细胞中表达的sgRNA进行测序。与预期的结果一致，观察到被富图2哺乳动物细胞中利用慢病毒CRISPR-Cas9系统的遗传筛选流程Fig.2FlowchartofgeneticscreeninginmammaliancellsbyusingalentiviralCRISPR-Cas9system

396遗传Hereditas(Beijing)2016第38卷图3利用小鼠全基因组CRISPR-Cas9敲除文库(mGeCKOa)的肿瘤生长和迁移筛选Fig.3CRISPRscreenoftumorgrowthandmetastasiswithmGeCKOalibrary细胞系，再用sgRNA混合文库侵染。在培养1周之后，文库稳定表达并具有足够的拷贝数与均匀性，然后将该细胞系(mGeCKOa-transduced)与对照组细胞系(Untransduced)各自移植到小鼠体内，并分别对早期肿瘤与晚期肿瘤的样本进行分析。研究者们发现，经文库侵染的一些细胞最终具有高迁移能力，而对照组细胞系形成的肿瘤均不具有迁移性。利用第二代测序技术，研究者们分别鉴定了在肿瘤原位与转移灶处被敲除的基因，这些基因的功能可能是抑制肿瘤生长或迁移。在这些结果中，排名较高者包含了之前已经被报道过的肿瘤抑制基因，NF2、Pten和Cdkn2a。此外，还有一些microRNA，如miR-345、miR152。Chen等[19]的工作为体内CRISPR筛选提供了一个完整的路线图，这个模型在未来可能被更广泛的应用于疾病的体内研究。全基因组CRISPR筛选可以应用于几乎任何细胞系和任何遗传背景下的遗传筛选，比如EGFR、KRAS、ALK突变型，或其他人类肿瘤细胞系。而采用其他的递送方法，比如静脉注射或原位移植，将有助于鉴定那些在肿瘤外渗和成血管化过程中起作用的基因。此外，检测不同时期与位置的肿瘤样本，如循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcells，CTCs)或已迁移肿瘤，可以更好的理解肿瘤在体内的演化过程。除此之外，体内CRISPR筛选模型还可以进行更细致的调整，以适应不同的实验需要。将体内筛选策略与药物治疗或免疫治疗共同运用，可以鉴定功能与抗性有关的基因。利用其他的筛选技术，如Cas9激活技术(Cas9-mediatedactivation)，可以作为一种功能获得性筛选策略，鉴定在肿瘤迁移

【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展[J]. 郑武,谷峰.  遗传. 2015(10)
[2]高通量siRNA筛选技术发展与展望[J]. 席建忠,马明,王干诚,骆宇峰.  生命科学. 2014(03)
[3]CRISPR/Cas系统:RNA靶向的基因组定向编辑新技术[J]. 李君,张毅,陈坤玲,单奇伟,王延鹏,梁振,高彩霞.  遗传. 2013(11)



本文编号：3008585