诺贝尔化学奖授予CRISPR-Cas9基因编辑研究
发布时间：2021-01-30 22:18
2020年,诺贝尔化学奖授予现就职于德国马普感染生物学研究所的法籍科学家Emmanuelle Charpentier和美国加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna,表彰她们发明CRISPR基因编辑方法.她们揭示了Cas9具有RNA介导的DNA核酸内切酶活性,可以切断任意DNA双链,产生双链断裂.她们指出CRISPR具有在活细胞中修改基因的作用,利用CRISPR-Cas9编辑工具,可以精确改变细胞中的DNA.由于简单、高效、廉价等特征,CRISPR已经成为最为流行的基因编辑技术,被称为基因编辑"魔剪".本文介绍了两位诺贝尔化学奖得主的研究成果,概述了CRISPR系统的发现历程,以及CRISPR-Cas9的功能和应用.
【文章来源】：生物化学与生物物理进展. 2020,47(11)北大核心
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
CRISPR-Cas领域关键研究成果
更多的基因组测序结果和生物信息学分析表明超过90%的古细菌和约50%的细菌中都有CRISPR-Cas系统.典型的CRISPR序列是由一段引导序列（leader）开始，引导序列中含有转录CRISPR序列所需的启动子.在引导序列之后是多个高度重复序列（repeat）和将这些重复序列隔开的长短不一的间隔序列（spacer）（图2).CRISPR序列中repeat序列具有种属特异性，而spacer序列与某些病毒或质粒的序列同源[17-18]，表明这些spacer序列可能来自外源入侵的核酸.2 CRISPR是原核生物体内的获得性免疫系统
Cas9的HNH和Ruv C核酸酶结构域分别负责切割ds DNA的TS链和NTS (non-target strand）链.突变HNH活性位点，TS链切割受到抑制，而NTS链的切割因Ruv C的突变而受到抑制.结构生物学的发现解释了Cas9两种核酸酶结构域分别切割ds DNA两条链的分子机制.Cas9由NUC lobe和REC lobe组成二裂片的结构，含多个正电荷氨基酸富集的核酸结合通道.在Cas9-sg RNA-DNA的结构中，可以观察到sg RNA与DNA形成一个“R-loop”的结构.cr RNA与TS互补配对，形成cr RNA∶TS杂合双链体.结合在REC lobe和NUC lobe形成的中间通道内，HNH结构域在杂合双链中TS上的切割位点附近对其进行切割，而NTS沿着另一条位于NUC lobe的核酸结构通道伸入Ruv C结构域的活性口袋附近被切割（图3).PAM序列对于Cas9识别和切割靶标DNA至关重要.Charpentier与Doudna验证ds DNA protospacer附近的序列对DNA结合和切割的影响，发现protospacer下游5′-NGG-3′PAM序列是Spy Cas9识别DNA的必要条件.当突变PAM序列，Spy Cas9结合ds DNA的亲和力大幅度减弱，切割DNA的活性也随之降低.Cas9的C端含有PI结构域，它特异性读取位于NTS上的PAM序列，这影响ds DNA的稳定性促使其解链，并促进向导RNA与互补DNA杂合形成R-loop结构.通过PI结构域氨基酸与PAM位点核苷酸碱基的特异性相互作用，不同的Cas9识别不同类型的PAM序列.CRISPR位点的spacer附近无PAM序列，而外源核酸protospacer附近含PAM特征序列，因此PAM序列的识别是CRISPR-Cas9区分“自我”和“非我”的关键因素.Cas9通过PAM区分自身与异己ds DNA,cr RNA∶TS互补配对形成R-loop，实现对靶DNA的精准切割，为基因编辑提供可靠的剪刀.基于Cas9的结构，还可对PI结构域与ds DNA结合的氨基酸进行改造，识别不同的PAM序列，扩大基因编辑工具包[30].
【参考文献】：
期刊论文
[1]Crystal structure of Cas1 in complex with branched DNA[J]. Jing Yang,Jiazhi Li,Jiuyu Wang,Gang Sheng,Min Wang,Hongtu Zhao,Yanhua Yang,Yanli Wang. Science China（Life Sciences）. 2020(04)
本文编号：3009684
【文章来源】：生物化学与生物物理进展. 2020,47(11)北大核心
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
CRISPR-Cas领域关键研究成果
更多的基因组测序结果和生物信息学分析表明超过90%的古细菌和约50%的细菌中都有CRISPR-Cas系统.典型的CRISPR序列是由一段引导序列（leader）开始，引导序列中含有转录CRISPR序列所需的启动子.在引导序列之后是多个高度重复序列（repeat）和将这些重复序列隔开的长短不一的间隔序列（spacer）（图2).CRISPR序列中repeat序列具有种属特异性，而spacer序列与某些病毒或质粒的序列同源[17-18]，表明这些spacer序列可能来自外源入侵的核酸.2 CRISPR是原核生物体内的获得性免疫系统
Cas9的HNH和Ruv C核酸酶结构域分别负责切割ds DNA的TS链和NTS (non-target strand）链.突变HNH活性位点，TS链切割受到抑制，而NTS链的切割因Ruv C的突变而受到抑制.结构生物学的发现解释了Cas9两种核酸酶结构域分别切割ds DNA两条链的分子机制.Cas9由NUC lobe和REC lobe组成二裂片的结构，含多个正电荷氨基酸富集的核酸结合通道.在Cas9-sg RNA-DNA的结构中，可以观察到sg RNA与DNA形成一个“R-loop”的结构.cr RNA与TS互补配对，形成cr RNA∶TS杂合双链体.结合在REC lobe和NUC lobe形成的中间通道内，HNH结构域在杂合双链中TS上的切割位点附近对其进行切割，而NTS沿着另一条位于NUC lobe的核酸结构通道伸入Ruv C结构域的活性口袋附近被切割（图3).PAM序列对于Cas9识别和切割靶标DNA至关重要.Charpentier与Doudna验证ds DNA protospacer附近的序列对DNA结合和切割的影响，发现protospacer下游5′-NGG-3′PAM序列是Spy Cas9识别DNA的必要条件.当突变PAM序列，Spy Cas9结合ds DNA的亲和力大幅度减弱，切割DNA的活性也随之降低.Cas9的C端含有PI结构域，它特异性读取位于NTS上的PAM序列，这影响ds DNA的稳定性促使其解链，并促进向导RNA与互补DNA杂合形成R-loop结构.通过PI结构域氨基酸与PAM位点核苷酸碱基的特异性相互作用，不同的Cas9识别不同类型的PAM序列.CRISPR位点的spacer附近无PAM序列，而外源核酸protospacer附近含PAM特征序列，因此PAM序列的识别是CRISPR-Cas9区分“自我”和“非我”的关键因素.Cas9通过PAM区分自身与异己ds DNA,cr RNA∶TS互补配对形成R-loop，实现对靶DNA的精准切割，为基因编辑提供可靠的剪刀.基于Cas9的结构，还可对PI结构域与ds DNA结合的氨基酸进行改造，识别不同的PAM序列，扩大基因编辑工具包[30].
【参考文献】：
期刊论文
[1]Crystal structure of Cas1 in complex with branched DNA[J]. Jing Yang,Jiazhi Li,Jiuyu Wang,Gang Sheng,Min Wang,Hongtu Zhao,Yanhua Yang,Yanli Wang. Science China（Life Sciences）. 2020(04)
本文编号：3009684
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3009684.html
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