MdERF2基因启动子的克隆及其转录活性分析
发布时间：2021-01-30 21:31
苹果是典型的呼吸跃变型果实,在其生长发育过程中,乙烯起了至关重要的作用。ERF家族转录因子属于乙烯信号通路中直接对靶基因起作用的关键因子,而MdERF2基因是乙烯调控苹果果实发育与品质的重要的转录因子,但目前对于乙烯调控MdERF2的机理及效果仍然不能确定,本文分析了MdERF2基因启动子序列特性,并利用含β-葡萄糖苷酸酶（GUS）和绿色荧光蛋白（GFP）的瞬时表达载体,双重研究和验证了乙烯及其抑制剂1-MCP对MdERF2基因启动子的调控模式,主要结果如下:采用PCR技术扩增MdERF2基因启动子,序列分析表明,扩增获得的启动子全长为1348 bp。利用Plant CARE和PLACE数据库分析基因启动子中所含有的顺式作用元件,发现具有TATA框和CAAT框等基础元件,还具有GARE-motif、CCAAT-box、Box4、GT1-motif和MBS等其它元件。构建pRI-ProMdERF2-GUS启动子瞬时表达载体,采用农杆菌介导法瞬时转化番茄果实和叶片来验证启动子的活性。结果表明:由Pro MdERF2驱动的GUS基因,在1-MCP、乙烯利以及空白的三种处理下,番茄果实和叶片均...
【文章来源】：山东理工大学山东省
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
新红星苹果基因组DNA的提取结果
山东理工大学硕士学位论文第二章苹果MdERF2启动子扩增与瞬时表达载体的构建212.3.2MdERF2基因启动子的PCR扩增以ERF2-F/ERF2-R为扩增引物，提取的新红星苹果基因组DNA为模板扩增MdERF2基因启动子序列，琼脂糖凝胶电泳结果显示，扩增出一条约1300bp左右的条带（图2.2），扩增出的特异性产物大小均与预期PCR产物大小一致。图2.2MdERF2基因启动子PCR产物Fig.2.2PCRproductofMdERF2genepromoter注：M：DL2000Marker；1-6：MdERF2基因启动子PCR产物2.3.3启动子序列测序及序列分析将PCR扩增的产物送至上海生工生物工程（济南）有限公司测序，序列采用在线软件预测其中的顺式作用元件，结果见图2.3。结果显示，PCR扩增所获得的启动子长度为1348bp，同源比对结果显示与NCBI上苹果MdERF2基因启动子序列的同源性达到99%，将该启动子命名为ProMdERF2。表2.9核心启动子区域预测Tab.2.9Predictionofcorepromoter起始位点结束位点得分核心启动子区-581-5300.99TCAGTGTGCATATAGAAACCGTGCAGCCCCAACGGCACACGTGACAGAAG-41+100.99CCTGACTTCTATATATACCCCTAGATACCTTCTCTTCCACAATTCGTGAA采用BerkeleyDrosophilaGenomeProject数据库对ProMdERF2序列中所含的核心区域进行预测，预测结果表明该序列中含两处核心启动子区域，结果见表2.9。使用Softberry
山东理工大学硕士学位论文第二章苹果MdERF2启动子扩增与瞬时表达载体的构建26表2.14MatrixCatch2.7软件预测结果Tab.2.14ForecastresultsfromMatrixCatch2.7softwareFactornameP-ValueSequenceCREBP1CJUN1.051e-02TGACTTTGCAATTTCCATTCHNF31.720e-02GTTGTATATCCTAGttgtaacttgtaagtgtgtcaATAAAAAAATAAAHNF33.518e-02TCAGTTTGACAACGcatgctgagagtaactacagataAAAACTAAACATGNFKBHMGIY1.963e-02AGGCAGAAAATT2.3.5pRI-ProMdERF2-GFP表达载体的构建用HindIII和XbaI双酶切MdERF2启动子片段，同时用HindIII和XbaI双酶切pRI-101-GFP载体，分别回收线性化的pRI-101-GFP载体（图2.4a）和启动子片段（图2.4b）。经HindIII和XbaI双酶切获得的MdERF2启动子与经相同限制性核酸内切酶双酶切获得的线性化载体，用T4-DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含50mg/LKan的LB固体培养基筛选培养。图2.4pRI-101-GFP载体及MdERF2启动子片段用HindIII和XbaI双酶切回收电泳图Fig.2.4RecoveryelectrophoresisofpRI-101-GFPvectorandpromoterfragmentsbydigestwithHindIIIandXbaI注：a：pRI-101-GFP载体酶切回收图（M：DL15000Marker；1：pRI-101-GFP载体用HindIII和XbaI双酶切回收图）；b：ERF2启动子酶切回收图（M：DL2000Marker；1：MdERF2启动子用HindIII和XbaI双酶切回收图）
本文编号：3009621
【文章来源】：山东理工大学山东省
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【学位级别】：硕士
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新红星苹果基因组DNA的提取结果
山东理工大学硕士学位论文第二章苹果MdERF2启动子扩增与瞬时表达载体的构建212.3.2MdERF2基因启动子的PCR扩增以ERF2-F/ERF2-R为扩增引物，提取的新红星苹果基因组DNA为模板扩增MdERF2基因启动子序列，琼脂糖凝胶电泳结果显示，扩增出一条约1300bp左右的条带（图2.2），扩增出的特异性产物大小均与预期PCR产物大小一致。图2.2MdERF2基因启动子PCR产物Fig.2.2PCRproductofMdERF2genepromoter注：M：DL2000Marker；1-6：MdERF2基因启动子PCR产物2.3.3启动子序列测序及序列分析将PCR扩增的产物送至上海生工生物工程（济南）有限公司测序，序列采用在线软件预测其中的顺式作用元件，结果见图2.3。结果显示，PCR扩增所获得的启动子长度为1348bp，同源比对结果显示与NCBI上苹果MdERF2基因启动子序列的同源性达到99%，将该启动子命名为ProMdERF2。表2.9核心启动子区域预测Tab.2.9Predictionofcorepromoter起始位点结束位点得分核心启动子区-581-5300.99TCAGTGTGCATATAGAAACCGTGCAGCCCCAACGGCACACGTGACAGAAG-41+100.99CCTGACTTCTATATATACCCCTAGATACCTTCTCTTCCACAATTCGTGAA采用BerkeleyDrosophilaGenomeProject数据库对ProMdERF2序列中所含的核心区域进行预测，预测结果表明该序列中含两处核心启动子区域，结果见表2.9。使用Softberry
山东理工大学硕士学位论文第二章苹果MdERF2启动子扩增与瞬时表达载体的构建26表2.14MatrixCatch2.7软件预测结果Tab.2.14ForecastresultsfromMatrixCatch2.7softwareFactornameP-ValueSequenceCREBP1CJUN1.051e-02TGACTTTGCAATTTCCATTCHNF31.720e-02GTTGTATATCCTAGttgtaacttgtaagtgtgtcaATAAAAAAATAAAHNF33.518e-02TCAGTTTGACAACGcatgctgagagtaactacagataAAAACTAAACATGNFKBHMGIY1.963e-02AGGCAGAAAATT2.3.5pRI-ProMdERF2-GFP表达载体的构建用HindIII和XbaI双酶切MdERF2启动子片段，同时用HindIII和XbaI双酶切pRI-101-GFP载体，分别回收线性化的pRI-101-GFP载体（图2.4a）和启动子片段（图2.4b）。经HindIII和XbaI双酶切获得的MdERF2启动子与经相同限制性核酸内切酶双酶切获得的线性化载体，用T4-DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含50mg/LKan的LB固体培养基筛选培养。图2.4pRI-101-GFP载体及MdERF2启动子片段用HindIII和XbaI双酶切回收电泳图Fig.2.4RecoveryelectrophoresisofpRI-101-GFPvectorandpromoterfragmentsbydigestwithHindIIIandXbaI注：a：pRI-101-GFP载体酶切回收图（M：DL15000Marker；1：pRI-101-GFP载体用HindIII和XbaI双酶切回收图）；b：ERF2启动子酶切回收图（M：DL2000Marker；1：MdERF2启动子用HindIII和XbaI双酶切回收图）
本文编号：3009621
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