RFX5调控原钙粘蛋白α基因簇的表达
发布时间：2021-02-03 04:26
基因的表达调控与基因组在细胞核内的三维空间架构相辅相成,原钙粘蛋白（protocadherin, Pcdh）基因簇在大脑发育中起到关键作用,可以作为研究基因表达调控机制的模式基因。转录因子RFX5 （regulatory factor x 5）是翼螺旋家族（winged HLH family）的成员,其蛋白由寡聚化结构域、DNA结合域、螺旋结构域和激活域组成,在调控免疫系统的主要组织相容性复合物II类（major histocompatibility complex class II, MHC II）的表达中起着至关重要的作用。本研究发现RFX5与CTCF在全基因组上结合的位点有部分重叠,利用CRISPR/Cas9DNA大片段编辑技术,构建了RFX5基因缺失的HEC-1-B细胞系。通过RNA-seq实验,发现RFX5敲除能够显著升高Pcdhα6、Pcdhα12、Pcdhαc2的表达水平。通过ChIP-nexus实验,发现敲除RFX5导致染色质架构蛋白CTCF和cohesin在原钙粘蛋白α基因簇处的结合增加。最后,染色质构象捕获QHR-4C实验发现Pcdhα6、Pcdhα12启动子与远端...
【文章来源】：遗传. 2020,42(08)北大核心
【文章页数】：15 页
【部分图文】：
使用CRISPR/Cas9技术建立RFX5基因敲除的单细胞克隆株
本研究使用CRISPR/Cas9技术，通过导入两个sgRNA，将Cas9蛋白定位在目的片段处进行切割，造成DNA双链断裂，经细胞修复机制得到RFX5基因敲除的单细胞克隆株K30和K56。K30的两条染色体有一个碱基不同，而K56两条染色体基因型相同。本研究对这两个单细胞克隆株的RNA-seq、ChIP-nexus、以及染色质构象捕获实验发现，RFX5敲除后，Pcdhα6、Pcdhα12、Pcdhαc2转录升高。推测这些转录水平变化是由于RFX5敲除后，蛋白CTCF和cohesin在原钙粘蛋白α基因簇的结合升高，使得增强子与启动子之间的染色质相互作用增加而导致的(图5)。该现象表明RFX5蛋白通过抑制CTCF和cohesin与DNA的结合调控染色质高级结构，从而参与原钙粘蛋白α基因簇的转录调控(图5)。然而通过ChIP-nexus和染色质构象捕获QHR-4C实验，发现敲除RFX5基因后，原钙粘蛋白α基因簇中启动子以及增强子HS5-1处的CTCF和cohesin的结合水平升高。在RFX5敲除的单细胞克隆株中，Pcdhα6和Pcdhα12启动子处的CTCF/cohesin结合增加，以及这两个启动子与增强子HS5-1之间的染色质相互作用增加，这些均能解释Pcdhα6和Pcdhα12这两个基因转录水平升高的现象。但是，RFX5的敲除如何上调Pcdhαc2的转录水平仍是未解决的问题。Pcdhαc2是原钙粘蛋白α基因簇的特殊一员，它的启动子上没有CTCF蛋白的结合，并且它的转录不受增强子HS5-1的调控，而是由另外一个增强子HS7调控[12,57,58]。本研究在Pcdhαc2的启动子上没有发现RFX5的结合，但在增强子HS7上发现有RFX5的强结合，说明RFX5可能通过结合增强子HS7调控Pcdhαc2的转录。
基于RFX5对CTCF和cohesin复合体在原钙粘蛋白α基因簇位点结合水平的影响，推测RFX5可能通过影响染色质三维空间构象从而调控原钙粘蛋白α基因簇的表达，因此对原钙粘蛋白α基因簇进行可定量的高分辨率染色质构象捕获(QHR-4C)实验。该实验能够研究某个观测点(viewpoint,VP)与全基因组其他位点之间的空间关系[15]。本研究首先以增强子HS5-1为观测点，发现在野生型细胞中，HS5-1与Pcdhαc1以及Pcdhα6-Pcdhα12之间形成远距离的染色质环(图4A)。在RFX5敲除的两个单细胞克隆株K30和K56中，HS5-1与这些基因之间的远距离相互作用增加(图4A)。为了进一步确定这些基因组位点间空间结构的变化，选取Pcdhα12启动子为观测点，发现在RFX5基因敲除的两个单细胞克隆株中，Pcdhα12与增强子HS5-1之间的远距离相互作用也同样增加(图4B)。这些结果说明，敲除RFX5基因后，原钙粘蛋白α基因簇启动子与远端增强子HS5-1之间的染色质相互作用增强，这可能是Pcdhα基因表达上调的原因。综上所述，本研究发现敲除RFX5基因导致原钙粘蛋白α基因簇表达升高，并且RFX5会阻碍CTCF蛋白和cohesin蛋白复合体在原钙粘蛋白α基因簇的结合。此外，RFX5参与调控染色质环的形成，进而影响染色质三维空间结构。
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9基因编辑在三维基因组研究中的应用[J]. 刘沛峰,吴强. 遗传. 2020(01)
[2]原钙粘蛋白基因簇调控区域中成簇的CTCF结合位点分析[J]. 翟亚男,许泉,郭亚,吴强. 遗传. 2016(04)
[3]CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段编辑中的应用[J]. 李金环,寿佳,吴强. 遗传. 2015(10)
[4]人类原钙粘蛋白基因簇调控元件的克隆及对其启动子活性的影响[J]. 吴海洋,郭亚,李伟,吴强. 生命科学研究. 2014(02)
本文编号：3015900
【文章来源】：遗传. 2020,42(08)北大核心
【文章页数】：15 页
【部分图文】：
使用CRISPR/Cas9技术建立RFX5基因敲除的单细胞克隆株
本研究使用CRISPR/Cas9技术，通过导入两个sgRNA，将Cas9蛋白定位在目的片段处进行切割，造成DNA双链断裂，经细胞修复机制得到RFX5基因敲除的单细胞克隆株K30和K56。K30的两条染色体有一个碱基不同，而K56两条染色体基因型相同。本研究对这两个单细胞克隆株的RNA-seq、ChIP-nexus、以及染色质构象捕获实验发现，RFX5敲除后，Pcdhα6、Pcdhα12、Pcdhαc2转录升高。推测这些转录水平变化是由于RFX5敲除后，蛋白CTCF和cohesin在原钙粘蛋白α基因簇的结合升高，使得增强子与启动子之间的染色质相互作用增加而导致的(图5)。该现象表明RFX5蛋白通过抑制CTCF和cohesin与DNA的结合调控染色质高级结构，从而参与原钙粘蛋白α基因簇的转录调控(图5)。然而通过ChIP-nexus和染色质构象捕获QHR-4C实验，发现敲除RFX5基因后，原钙粘蛋白α基因簇中启动子以及增强子HS5-1处的CTCF和cohesin的结合水平升高。在RFX5敲除的单细胞克隆株中，Pcdhα6和Pcdhα12启动子处的CTCF/cohesin结合增加，以及这两个启动子与增强子HS5-1之间的染色质相互作用增加，这些均能解释Pcdhα6和Pcdhα12这两个基因转录水平升高的现象。但是，RFX5的敲除如何上调Pcdhαc2的转录水平仍是未解决的问题。Pcdhαc2是原钙粘蛋白α基因簇的特殊一员，它的启动子上没有CTCF蛋白的结合，并且它的转录不受增强子HS5-1的调控，而是由另外一个增强子HS7调控[12,57,58]。本研究在Pcdhαc2的启动子上没有发现RFX5的结合，但在增强子HS7上发现有RFX5的强结合，说明RFX5可能通过结合增强子HS7调控Pcdhαc2的转录。
基于RFX5对CTCF和cohesin复合体在原钙粘蛋白α基因簇位点结合水平的影响，推测RFX5可能通过影响染色质三维空间构象从而调控原钙粘蛋白α基因簇的表达，因此对原钙粘蛋白α基因簇进行可定量的高分辨率染色质构象捕获(QHR-4C)实验。该实验能够研究某个观测点(viewpoint,VP)与全基因组其他位点之间的空间关系[15]。本研究首先以增强子HS5-1为观测点，发现在野生型细胞中，HS5-1与Pcdhαc1以及Pcdhα6-Pcdhα12之间形成远距离的染色质环(图4A)。在RFX5敲除的两个单细胞克隆株K30和K56中，HS5-1与这些基因之间的远距离相互作用增加(图4A)。为了进一步确定这些基因组位点间空间结构的变化，选取Pcdhα12启动子为观测点，发现在RFX5基因敲除的两个单细胞克隆株中，Pcdhα12与增强子HS5-1之间的远距离相互作用也同样增加(图4B)。这些结果说明，敲除RFX5基因后，原钙粘蛋白α基因簇启动子与远端增强子HS5-1之间的染色质相互作用增强，这可能是Pcdhα基因表达上调的原因。综上所述，本研究发现敲除RFX5基因导致原钙粘蛋白α基因簇表达升高，并且RFX5会阻碍CTCF蛋白和cohesin蛋白复合体在原钙粘蛋白α基因簇的结合。此外，RFX5参与调控染色质环的形成，进而影响染色质三维空间结构。
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9基因编辑在三维基因组研究中的应用[J]. 刘沛峰,吴强. 遗传. 2020(01)
[2]原钙粘蛋白基因簇调控区域中成簇的CTCF结合位点分析[J]. 翟亚男,许泉,郭亚,吴强. 遗传. 2016(04)
[3]CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段编辑中的应用[J]. 李金环,寿佳,吴强. 遗传. 2015(10)
[4]人类原钙粘蛋白基因簇调控元件的克隆及对其启动子活性的影响[J]. 吴海洋,郭亚,李伟,吴强. 生命科学研究. 2014(02)
本文编号：3015900
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3015900.html
最近更新
教材专著
