Cystatin基因在酵母中的重组表达及其在鱼糜中的应用
发布时间：2021-02-03 08:38
半胱氨酸蛋白酶抑制剂,也称为胱抑素,在各种生物中广泛存在着,其能够抑制活性中心中含有半胱氨酸（cySH）残基的半胱氨酸蛋白酶。与半胱氨酸蛋白酶抑制剂C相比,半胱氨酸蛋白酶抑制剂F抑制半胱氨酸蛋白酶的机制很少报道。在本研究中,首先构建重组质粒pPIC9K-CST7,之后将其导入进巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中。经甲醇诱导表达及组氨酸标签纯化最终获得一种具有活性的重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂F。测量重组胱抑素F的抑制活性,并计算IC50为4.78μM。利用Lineweaver-Burk双倒数分析法对抑制类型进行分析,发现在添加不同重组胱抑素F浓度的蛋白酶水解反应中,未观察到Vmax的明显变化,而Km值随抑制剂浓度的增加而增加,胱抑素F的抑制类型为与蛋白酶底物的竞争性抑制。等温滴定量热分析显示出其与木瓜蛋白酶的结合能力（Kd=9.387×10-7M）,根据化学计量比显示重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂F与木瓜蛋白酶相结合的比例为1:1。在胱抑素F和木瓜蛋白酶的结合过程中,β-折叠的二级结构显著增加,无规则卷曲的百分比减少,荧光强度在逐渐降低。结合木瓜蛋白酶晶体结构（PDB ...
【文章来源】：大连工业大学辽宁省
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重组质粒构建示意图
第二章Cystatin基因在酵母中的重组表达242.3结果与讨论2.3.1CST7基因的获得与重组质粒的构建2.3.1.1CST7基因的获得从猪的肝脏组织中提取RNA时，肝脏组织的新鲜程度影响着RNA的提取效果，如图2.1所示当RNA的琼脂糖电泳图达到28s，18s以及5s三条条带清晰不拖尾或者仅有少量的拖尾现象，根据实验结果选取Abs260/280的数值为2.04的样本，浓度为1228ng/μL，用作下一步反转录实验使用。图2.2猪总RNA提取琼脂糖电泳图Figure2.2AgarosegelelectrophoresisforthepigTotalRNA将提取得到的猪的总RNA，经过反转录实验得到cDNA序列，根据NCBI网站上半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因CST7基因序列（GeneID:100152012）所设计的引物SsCyt-F和SsCyt-R，经过PCR反应得到带有酶切位点的CST7基因，如图2.1所示，CST7基因总长为441bp加上引物长度43bp条带总长484bp。2.3.1.2重组质粒的验证按照2.2.4.1所述方法，将pPIC9K质粒与目的基因CST7相连接组成重组质粒导入大肠杆菌中，导入成功的大肠杆菌可以在筛选培养基上生长。挑取菌落在液体培养基中培养成菌液，使用通用引物GAL/CYC对导入重组质粒的大肠杆菌菌液进行PCR验证。
第二章Cystatin基因在酵母中的重组表达25由pPIC9K全序列可知，在导入目的基因后的质粒使用通用引物PCR验证基因片段结果为624bp，如图2.3所示。图2.3CST7基因扩增产物的琼脂糖电泳图Figure2.3AgarosegelelectrophoresisfortheamplificationproductofCST7gene图2.4重组质粒pPIC9K-CST7的菌液PCR验证Figure2.4AgarosegelelectrophoresisfortherecombinantplasmidpPIC9K-CST7bacterialfluidPCRverification
【参考文献】：
期刊论文
[1]Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂IsKuI-1的原核表达、纯化及活性研究[J]. 崔宏娣,邵正,邓莉,司徒永立,彭礼飞. 中国生物工程杂志. 2014(12)
[2]鲢鱼卵中低分子CPIs的纯化鉴定及改善鱼糜凝胶强度的效果研究[J]. 刘玲,蒋然然,彭海鑫,李艳芳,任阳阳,肖安蓬,陈海,李树红. 食品科学. 2014(13)
[3]低温诱导对毕赤酵母表达重组外源蛋白的影响[J]. 廖锡豪,陈明祥,谢万勇,韩双艳,林影. 中国酿造. 2013(02)
[4]内源性蛋白酶对宰后肌肉嫩化机制研究进展[J]. 黄明,黄峰,黄继超,徐宝才,周光宏,徐幸莲. 中国农业科学. 2011(15)
[5]超高压处理对梅鱼鱼糜凝胶特性的影响[J]. 胡飞华,陆海霞,陈青,励建荣. 水产学报. 2010(03)
[6]基质金属蛋白酶抑制剂研究进展[J]. 韩寒,刘克良. 国际药学研究杂志. 2008(03)
[7]巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略[J]. 胡世界,罗素兰,张吉贞,长孙东亭. 生物技术. 2007(06)
[8]重组毕赤酵母表达reteplase发酵过程中的降解现象[J]. 方曙光,储炬,黄立,庄英萍,张嗣良. 华东理工大学学报(自然科学版). 2006(12)
[9]蛋白酶抑制剂的研究与应用[J]. 曲晓华,浦冠勤. 蚕桑茶叶通讯. 2003(01)
[10]血清金属基质蛋白酶及其抑制因子检测在肝病中的应用[J]. 李东,杨新英. 临床肝胆病杂志. 2002(03)
硕士论文
[1]鲤鱼卵半胱氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化、部分性质分析和基因克隆[D]. 杨书婷.苏州大学 2015
[2]鲢鱼卵CPIs的纯化鉴定及其抑制鱼糜凝胶软化的研究[D]. 宋川.四川农业大学 2011
本文编号：3016217
【文章来源】：大连工业大学辽宁省
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重组质粒构建示意图
第二章Cystatin基因在酵母中的重组表达242.3结果与讨论2.3.1CST7基因的获得与重组质粒的构建2.3.1.1CST7基因的获得从猪的肝脏组织中提取RNA时，肝脏组织的新鲜程度影响着RNA的提取效果，如图2.1所示当RNA的琼脂糖电泳图达到28s，18s以及5s三条条带清晰不拖尾或者仅有少量的拖尾现象，根据实验结果选取Abs260/280的数值为2.04的样本，浓度为1228ng/μL，用作下一步反转录实验使用。图2.2猪总RNA提取琼脂糖电泳图Figure2.2AgarosegelelectrophoresisforthepigTotalRNA将提取得到的猪的总RNA，经过反转录实验得到cDNA序列，根据NCBI网站上半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因CST7基因序列（GeneID:100152012）所设计的引物SsCyt-F和SsCyt-R，经过PCR反应得到带有酶切位点的CST7基因，如图2.1所示，CST7基因总长为441bp加上引物长度43bp条带总长484bp。2.3.1.2重组质粒的验证按照2.2.4.1所述方法，将pPIC9K质粒与目的基因CST7相连接组成重组质粒导入大肠杆菌中，导入成功的大肠杆菌可以在筛选培养基上生长。挑取菌落在液体培养基中培养成菌液，使用通用引物GAL/CYC对导入重组质粒的大肠杆菌菌液进行PCR验证。
第二章Cystatin基因在酵母中的重组表达25由pPIC9K全序列可知，在导入目的基因后的质粒使用通用引物PCR验证基因片段结果为624bp，如图2.3所示。图2.3CST7基因扩增产物的琼脂糖电泳图Figure2.3AgarosegelelectrophoresisfortheamplificationproductofCST7gene图2.4重组质粒pPIC9K-CST7的菌液PCR验证Figure2.4AgarosegelelectrophoresisfortherecombinantplasmidpPIC9K-CST7bacterialfluidPCRverification
【参考文献】：
期刊论文
[1]Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂IsKuI-1的原核表达、纯化及活性研究[J]. 崔宏娣,邵正,邓莉,司徒永立,彭礼飞. 中国生物工程杂志. 2014(12)
[2]鲢鱼卵中低分子CPIs的纯化鉴定及改善鱼糜凝胶强度的效果研究[J]. 刘玲,蒋然然,彭海鑫,李艳芳,任阳阳,肖安蓬,陈海,李树红. 食品科学. 2014(13)
[3]低温诱导对毕赤酵母表达重组外源蛋白的影响[J]. 廖锡豪,陈明祥,谢万勇,韩双艳,林影. 中国酿造. 2013(02)
[4]内源性蛋白酶对宰后肌肉嫩化机制研究进展[J]. 黄明,黄峰,黄继超,徐宝才,周光宏,徐幸莲. 中国农业科学. 2011(15)
[5]超高压处理对梅鱼鱼糜凝胶特性的影响[J]. 胡飞华,陆海霞,陈青,励建荣. 水产学报. 2010(03)
[6]基质金属蛋白酶抑制剂研究进展[J]. 韩寒,刘克良. 国际药学研究杂志. 2008(03)
[7]巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略[J]. 胡世界,罗素兰,张吉贞,长孙东亭. 生物技术. 2007(06)
[8]重组毕赤酵母表达reteplase发酵过程中的降解现象[J]. 方曙光,储炬,黄立,庄英萍,张嗣良. 华东理工大学学报(自然科学版). 2006(12)
[9]蛋白酶抑制剂的研究与应用[J]. 曲晓华,浦冠勤. 蚕桑茶叶通讯. 2003(01)
[10]血清金属基质蛋白酶及其抑制因子检测在肝病中的应用[J]. 李东,杨新英. 临床肝胆病杂志. 2002(03)
硕士论文
[1]鲤鱼卵半胱氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化、部分性质分析和基因克隆[D]. 杨书婷.苏州大学 2015
[2]鲢鱼卵CPIs的纯化鉴定及其抑制鱼糜凝胶软化的研究[D]. 宋川.四川农业大学 2011
本文编号：3016217
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