一个稻瘟病抗性相关基因pi-G3的功能初探

发布时间：2021-02-04 17:41

　　稻瘟病由病原真菌稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）侵染引起,是水稻三大病害之一,对水稻中抗稻瘟病基因功能的分析有助于揭示水稻抗稻瘟病的机制,加快水稻抗病育种进程。本实验室前期通过GWAS分析得到的一个与抗稻瘟病相关、编码氧化还原酶的基因pi-G3,本文对该基因的功能进行了初步研究。分别构建了该基因CRISPR/Cas9敲除载体和超表达载体,通过农杆菌介导转化获得转基因植株。对获得的转基因植株利用打孔接种和ROS测定等实验进行抗病表型及相关生理生化指标鉴定,同时对该基因进行亚细胞定位。初步证明了pi-G3参与水稻抗稻瘟病的功能。具体研究结果如下:1、设计pi-G3基因编辑靶点构建CRISPR/Cas9载体pYB02-pi-G3,同时PCR扩增pi-G3 CDS全长构建超表达载体pROXs-HA-pi-G3,通过农杆菌转化获得转基因植株。2、对转基因植株进行普通PCR测序以及荧光定量PCR鉴定pi-G3基因型及转录水平变化,获得CRISPR突变体pi-G3-7-4,pi-G3-5-5;野生型:pi-G3-9-1;超表达植株:pi-G3-12-13,pi-G3-12-5。3、稻... 

【文章来源】：湖南农业大学湖南省

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 绪论
    1.1 稻瘟病对水稻的危害及防护措施
    1.2 植物抗病机制
    1.3 水稻抗稻瘟病研究进展
    1.4 氧化还原酶参与植物抗病反应
    1.5 生物信息学分析在水稻抗稻瘟病基因克隆研究中的应用
    1.6 CRISPR系统在植物种的应用
    1.7 目的和意义
第2章 候选基因的获得及克隆
    2.1 实验材料
        2.1.1 稻瘟菌小种,水稻材料,载体和菌株
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要实验设备
        2.1.4 培养基的主要成分及其配置方法
        2.1.5 抗生素使用浓度
    2.2 实验方法
        2.2.0 稻瘟菌培养
        2.2.1 常用菌种保存
        2.2.2 水稻叶片cDNA获得
        2.2.3 引物设计
        2.2.4 CRISPR/Cas9 载体构建
        2.2.5 超表达载体pROXs-HA载体构建
        2.2.6 亚细胞定位载体构建
        2.2.7 原核表达载体构建
    2.3 实验结果和分析
        2.3.1 候选基因的获得
        2.3.2 载体的构建及鉴定
    2.4 讨论
第3章 pi-G3 功能初探
    3.1 实验材料
        3.1.1 稻瘟菌生理小种,水稻转基因材料
        3.1.2 实验试剂
        3.1.3 主要实验设备
        3.1.4 培养基的主要成分及其配置方法
    3.2 实验方法
        3.2.1 水稻叶片DNA提取
        3.2.2 实时荧光定量PCR
        3.2.3 蛋白提取和Western blot检测
        3.2.4 ROS检测
        3.2.5 Punch打孔接种
        3.2.6 真菌生物量检测
        3.2.7 潮霉素筛选
    3.3 实验结果和分析
        3.3.1 pi-G3 CRISPR敲除突变体及超表达材料鉴定
        3.3.2 pi-G3 CRISPR敲除突变体抗性表型鉴定
        3.3.3 pi-G3 超表达突变体抗性表型鉴定
        3.3.4 突变体常规表型鉴定
    3.4 讨论
第4章 pi-G3 亚细胞定位以及原核表达
    4.1 实验材料
        4.1.1 水稻品种,载体
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 实验设备
        4.1.4 培养基以及试剂的主要成分及其配置方法
    4.2 实验方法
        4.2.1 酶液配制
        4.2.2 原生质体提取
        4.2.3 水稻原生质体转化过程
        4.2.4 原核表达
    4.3 实验结果与分析
        4.3.1 pi-G3 亚细胞定位
        4.3.2 pi-G3 原核表达
    4.4 讨论
参考文献
致谢
作者简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的克隆及原核表达[J]. 陈亚红,刘早利,王春台,刘新琼.  广东农业科学. 2016(04)
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[3]水稻先天免疫系统对南方黑条矮缩病的抗性分析[J]. 唐建淮,冯锐,郭辉.  农技服务. 2015(05)
[4]几种新型植物基因表达载体的构建方法[J]. 张阳璞,杨淑慎.  生物工程学报. 2015(03)
[5]水稻抗白叶枯病基因xa5的原核表达及蛋白纯化[J]. 范玉龙,张梦诗,李明容,翟文学,夏志辉.  热带农业科学. 2015(03)
[6]水稻抗白叶枯病相关基因的亚细胞定位[J]. 陈斌,李冬月,王栩鸣,周洁,严成其,陈剑平.  浙江农业学报. 2014(03)
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[10]稻瘟病监测预测方法研究现状及流行风险评估体系构建初探[J]. 齐龙,马旭,梁柏,张稳成,傅荣富,谭永炘.  中国农学通报. 2011(33)

博士论文
[1]水稻细菌性条斑病菌Ⅲ型效应因子功能的研究[D]. 李帅.中国农业大学 2015

硕士论文
[1]小麦赤霉病菌三个同源CYP51基因表达载体构建和遗传转化[D]. 王小蝉.安徽农业大学 2016
[2]ABIP1在稻瘟病Pib-AvrPib互作系统中的功能研究[D]. 陈文婷.华南农业大学 2016
[3]水稻品种Jefferson和谷梅2号广谱抗稻瘟病基因的发掘与定位[D]. 江南.湖南农业大学 2010
[4]水稻抗瘟性的生化机制研究[D]. 宋海超.华南热带农业大学 2003



本文编号：3018691