CHO细胞定点整合稳定表达治疗性蛋白质的研究
发布时间：2021-02-11 12:13
中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞是首个被美国FDA、欧盟EMA和中国CFDA认可的用于生物制药领域的生产细胞,已广泛应用于各种治疗性蛋白质药物的大规模制备。CHO细胞在治疗性蛋白质药物生产中的优势明确,但目前构建重组的生产型CHO细胞株还一直停留在目的基因随机整合,或基于外源基因倍增策略,通过筛选高表达细胞,以最终获得工程化表达细胞的研究思路。这导致建立的生产型CHO细胞株的表达性状的长期稳定性欠缺,构建生产型细胞株的效率低等问题。本研究以具有抗凋亡能力的CHO细胞株为研究材料,通过对稳定表达外源性基因位点的确认,构建了可以表达不同类型治疗性重组蛋白质的CHO表达细胞株,并对不同蛋白质类药物的表达稳定性进行了认证,主要结果如下:（1）以CHO-K1细胞系为研究材料,采用CRISPR/Cas9技术,通过CD513B-Cas9、sgRNA-BAK与sgRNA-BAX三个表达质粒一次性共转染,实现了对出发细胞凋亡相关基因的敲除。DNA序列测序发现实验细胞的目标靶点处序列均有明确的插入/删除;检测实验细胞均不再表达BAK与BAX蛋白质。对比野生型CHO-K...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：108 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
表达目的蛋白的重组细胞株构建及后期途径工程培养细胞[9]
不同细胞系染色体的数目也不恒定[1]。基因组的不稳定性，主要表现在其染色体层面上的拷贝数变异。早先的一项基于Giemsa-banding 技术检测，显示出中国仓鼠卵巢细胞拥有 22 条染色体，其中含 10 对常染色体及 2 条性染色体[21]。而 CHO-K1 细胞系则显示出与其有极大的不同，其仅有8 条染色体显示出同普通中国仓鼠染色体相同，而 13 个染色体则以“Z”标志，因其中包含着染色体重排、缺失、移位等现象（图 1.2 左侧框[1]）。此外，染色体异质性甚至还表现在了同一个 CHO 细胞系内部：比如 CHO-K1 细胞系的祖源细胞系，其中24%细胞群体，被发现所含有的染色体数目不是 21 条，比如为 19，20，22 或者 44 条[21]。一项关于 CHO-K1 细胞系的研究显示，染色体的“模式”数目为 20；所谓模式数目，指的是在不同个体细胞内，拥有不同数目的染色体数目，而 20 是其中最具有代表性的[22]。此外， CHO-DG44 细胞系内同样也出现了类似 20 条染色体的核型。在DG44 细胞系内，有 7 条常规染色体，4 条“Z”染色体以及 9 条衍生染色体。而在 30%-40%的重组 DG44 细胞系内，这种核型依然存在，尽管亚克隆细胞系内还存在着染色体重排现象[9]。
图 1.3 CRISPR/Cas9 工作原理示意图[36]Fig. 1.3 Schematic diagram of CRISPR/Cas9由于 CRISPR/Cas9 体系的操作简便性，其在各个领域中均有广泛的运用。CRIPSR/Cas9 除了直接用于基因编辑，也能够用于药物靶点的大规模筛选。现有的shRNA 文库筛选主要存在两个缺点：一是因为 RNAi 不能够做到完全 knock-down，因此会有很多假阴性；二是 RNAi 脱靶的频率高，会导致很多的假阳性。而 CRISPRi 技术可以减少这些干扰。由于 CRISPRi 技术是基于对目的基因能否转录进行直接调控，可直接使目的基因无法转录；而不是类似于 shRNA 是对已经转录好的 RNA 进行调控；同时由于 sgRNA 序列一般比较短，可以实现高通量的 array-based 寡核苷酸合成，从而构建 sgRNA 文库。CRISPRi LOF （loss-of-function）文库与 CRISPRa GOF（gain-of-function）文库都可以细胞生长为指标，大规模地分析癌细胞中的遗传依赖关系。此外，在加入某药品的情况下进行筛选，可以分析该药物产生耐药性的机制。比如在黑色素瘤细胞系 A375 中进行 BRAF 抑制剂 vemurafenib 的耐药性筛选发现，肿瘤抑制因子 NF2，culin E3 连接酶 CUL3 以及一些组蛋白质乙酰转移酶 STAGA 复合物
【参考文献】：
期刊论文
[1]稳定表达GLP-1类似物的CHO细胞株的构建及培养工艺研究[J]. 张晶晶,刘克东,钱凯,缪亚娜,蔡燕飞,李成媛,陈蕴,金坚. 中国生物工程杂志. 2017(05)
[2]信号肽对肝细胞生长因子HGF在CHO中表达及分泌的影响[J]. 徐栋生,陈蕴,金坚. 中国细胞生物学学报. 2016(12)
[3]基因编辑技术及其应用研究进展[J]. 夏天,林仙花,胡雪峰. 生物学教学. 2016(11)
本文编号：3029094
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：108 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
表达目的蛋白的重组细胞株构建及后期途径工程培养细胞[9]
不同细胞系染色体的数目也不恒定[1]。基因组的不稳定性，主要表现在其染色体层面上的拷贝数变异。早先的一项基于Giemsa-banding 技术检测，显示出中国仓鼠卵巢细胞拥有 22 条染色体，其中含 10 对常染色体及 2 条性染色体[21]。而 CHO-K1 细胞系则显示出与其有极大的不同，其仅有8 条染色体显示出同普通中国仓鼠染色体相同，而 13 个染色体则以“Z”标志，因其中包含着染色体重排、缺失、移位等现象（图 1.2 左侧框[1]）。此外，染色体异质性甚至还表现在了同一个 CHO 细胞系内部：比如 CHO-K1 细胞系的祖源细胞系，其中24%细胞群体，被发现所含有的染色体数目不是 21 条，比如为 19，20，22 或者 44 条[21]。一项关于 CHO-K1 细胞系的研究显示，染色体的“模式”数目为 20；所谓模式数目，指的是在不同个体细胞内，拥有不同数目的染色体数目，而 20 是其中最具有代表性的[22]。此外， CHO-DG44 细胞系内同样也出现了类似 20 条染色体的核型。在DG44 细胞系内，有 7 条常规染色体，4 条“Z”染色体以及 9 条衍生染色体。而在 30%-40%的重组 DG44 细胞系内，这种核型依然存在，尽管亚克隆细胞系内还存在着染色体重排现象[9]。
图 1.3 CRISPR/Cas9 工作原理示意图[36]Fig. 1.3 Schematic diagram of CRISPR/Cas9由于 CRISPR/Cas9 体系的操作简便性，其在各个领域中均有广泛的运用。CRIPSR/Cas9 除了直接用于基因编辑，也能够用于药物靶点的大规模筛选。现有的shRNA 文库筛选主要存在两个缺点：一是因为 RNAi 不能够做到完全 knock-down，因此会有很多假阴性；二是 RNAi 脱靶的频率高，会导致很多的假阳性。而 CRISPRi 技术可以减少这些干扰。由于 CRISPRi 技术是基于对目的基因能否转录进行直接调控，可直接使目的基因无法转录；而不是类似于 shRNA 是对已经转录好的 RNA 进行调控；同时由于 sgRNA 序列一般比较短，可以实现高通量的 array-based 寡核苷酸合成，从而构建 sgRNA 文库。CRISPRi LOF （loss-of-function）文库与 CRISPRa GOF（gain-of-function）文库都可以细胞生长为指标，大规模地分析癌细胞中的遗传依赖关系。此外，在加入某药品的情况下进行筛选，可以分析该药物产生耐药性的机制。比如在黑色素瘤细胞系 A375 中进行 BRAF 抑制剂 vemurafenib 的耐药性筛选发现，肿瘤抑制因子 NF2，culin E3 连接酶 CUL3 以及一些组蛋白质乙酰转移酶 STAGA 复合物
【参考文献】：
期刊论文
[1]稳定表达GLP-1类似物的CHO细胞株的构建及培养工艺研究[J]. 张晶晶,刘克东,钱凯,缪亚娜,蔡燕飞,李成媛,陈蕴,金坚. 中国生物工程杂志. 2017(05)
[2]信号肽对肝细胞生长因子HGF在CHO中表达及分泌的影响[J]. 徐栋生,陈蕴,金坚. 中国细胞生物学学报. 2016(12)
[3]基因编辑技术及其应用研究进展[J]. 夏天,林仙花,胡雪峰. 生物学教学. 2016(11)
本文编号：3029094
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3029094.html
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