多花水仙离体快繁技术研究及WD40基因表达分析

发布时间：2017-04-13 08:10

  本文关键词：多花水仙离体快繁技术研究及WD40基因表达分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：多花水仙为石蒜科(Amaryllidaceae)水仙属(Narcissus L.)多年生球根类花卉,具有较高的经济和观赏价值。长期的无性繁殖,大大限制了其繁殖速度且容易造成病毒积累,致使品种退化,抗性减弱。因此,提高多花水仙的抗性,加快其优质脱毒种苗的生产和优质新品种的推广,对于多花水仙持续发展至关重要。本研究以‘云香水仙’和白花Ⅱ水仙鳞茎为材料,研究了不同培养基对两个水仙品种离体培养的影响,筛选出适宜的培养基,为水仙脱毒种苗的生产、种质资源的保存和新品种的推广应用提供理论支持和技术指导,也为水仙品种改良充实基础资料。同时,本研究从福建农林大学园艺学院遗传育种研究所获得的‘云香水仙’转录组中筛选了与抗性有关的WD40基因片段,克隆了开放阅读框,并分析了该基因在非生物胁迫下的表达,以期为水仙品种改良提供参考。主要研究结果如下：1.本试验探索了‘云香水仙’和白花Ⅱ水仙的外植体消毒方法和较适培养基,‘云香水仙’和白花Ⅱ水仙鳞茎盘消毒处理分别以25%的次氯酸钠溶液浸泡30min和25 mmin为好；‘云香水仙’小鳞茎诱导最佳培养基：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D,白花Ⅱ水仙不定芽诱导最佳培养基：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L2,4-D；‘云香水仙’和白花Ⅱ水仙愈伤组织分化的最佳培养基分别为MS+5.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA和MS+3.0 mg/L 6-BA+O.5 mg/L NAA;‘云香水仙’和白花Ⅱ水仙继代的最佳培养基：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D;‘云香水仙’和白花Ⅱ水仙最佳的生根培养基为1/2MS+0.05 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA。‘云香水仙’和白花Ⅱ水仙离体再生体系的建立为转基因育种、原种保存、种质资源保存及新品种推广提供技术支持。2.通过RT-PCR技术获得了‘云香水仙’WD40基因(GenBank登录号：KU193745),并通过生物信息学手段及软件,对其结构特征进行了分析,并进行了功能预测。WD40基因包含一个420bp的开放阅读框,编码140个氨基酸,属疏水性蛋白,系统进化树分析结果表明,该基因编码的蛋白与海枣、小果野蕉、玉米等亲缘关系较近。3.对‘云香水仙’进行高温、盐、ABA非生物胁迫处理,荧光定量结果表明,WD40基因相对表达量出现了不同程度的上调,高温处理下WD40表达量变化最为显著,推测该基因参与了高温、盐、激素等非生物胁迫过程。
【关键词】：‘云香水仙’ 白花Ⅱ水仙 离体培养 WD40
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S682.21
【目录】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 缩略词12-13
• 第一章 前言13-23
• 1 水仙离体快繁技术的研究进展13-19
• 1.1 外植体的研究13-14
• 1.1.1 外植体的低温预处理13-14
• 1.1.2 外植体的切法14
• 1.2 水仙离体培养类型的研究14-15
• 1.2.1 营养器官培养14-15
• 1.2.2 生殖器官培养15
• 1.3 基本培养基的筛选15-16
• 1.4 激素种类与浓度的研究16-19
• 1.4.1 初代培养中激素的研究16-18
• 1.4.2 继代培养中激素影响的研究18
• 1.4.3 生根培养中激素的研究18-19
• 1.5 培养环境的研究19
• 2 WD40蛋白在植物中的研究进展19-21
• 2.1 WD40蛋白的结构特征20
• 2.2 WD40与植物花青素合成20-21
• 2.3 WD40与植物非生物胁迫21
• 3 研究意义和内容21-23
• 3.1 研究意义21-22
• 3.2 研究内容22-23
• 第二章 水仙快繁技术23-38
• 1 材料与方法23-26
• 1.1 试验材料23
• 1.2 方法23-26
• 1.2.1 外植体预处理及消毒23-24
• 1.2.2 培养基与培养条件24
• 1.2.3 外植体的接种24-25
• 1.2.4 继代增殖培养25
• 1.2.5 生根与壮苗培养25
• 1.2.6 炼苗和移栽25-26
• 2 结果与分析26-34
• 2.1 不同处理的消毒效果比较26-27
• 2.1.1 ‘云香水仙’消毒方法的筛选26
• 2.1.2 白花Ⅱ水仙消毒方法的筛选26-27
• 2.2 初代培养27-31
• 2.2.1 ‘云香水仙’鳞茎生长及分化的相关性分析27-29
• 2.2.2 白花Ⅱ水仙不定芽生长及分化的相关性分析29-30
• 2.2.3 最佳激素浓度的确定30-31
• 2.3 愈伤组织分化培养31-32
• 2.3.1 ‘云香水仙’愈伤组织的分化31-32
• 2.3.2 白花Ⅱ水仙愈伤组织的分化32
• 2.4 不同激素对水仙继代培养的影响32-33
• 2.4.1 ‘云香水仙’小鳞茎的继代33
• 2.4.2 白花Ⅱ水仙不定芽的继代33
• 2.5 激素对水仙生根的影响33-34
• 2.6 组培苗的移栽34
• 3 讨论34-38
• 3.1 消毒效果的比较34-35
• 3.2 激素浓度配比对水仙离体培养的影响35-36
• 3.3 外植体对初代培养的影响36
• 3.4 生根与移栽36-37
• 3.5 组培过程中遇到的问题37-38
• 第三章 WD40基因克隆及表达分析38-51
• 1 试验材料38-39
• 1.1 植物材料38
• 1.2 酶和试剂38-39
• 1.3 载体和菌株39
• 1.4 主要仪器设备和耗材39
• 2 试验方法39-43
• 2.1 非生物胁迫39-40
• 2.2 RNA提取40
• 2.3 RNA质量检测40
• 2.4 基因克隆40-42
• 2.4.1 cDNA合成40
• 2.4.2 引物设计40-41
• 2.4.3 PCR扩增41
• 2.4.4 目的片段回收41
• 2.4.5 目的片段连接41
• 2.4.6 转化大肠杆菌感受态41
• 2.4.7 阳性克隆的筛选与鉴定41-42
• 2.4.8 基因片段的测序与分析42
• 2.5 实时荧光定量PCR实验42-43
• 2.5.1 cDNA合成42
• 2.5.2 qPCR42-43
• 3 结果与分析43-49
• 3.1 ‘云香水仙’WD40基因的克隆和序列分析43-47
• 3.1.1 RNA质量43-44
• 3.1.2 WD40的克隆44
• 3.1.3 WD40基因的生物信息学分析44-47
• 3.2 ‘云香水仙’WD40基因表达分析47-49
• 3.2.1 RNA质量47
• 3.2.2 ‘云香水仙’WD40基因在不同非生物胁迫下的表达水平47-49
• 4 讨论49-51
• 第四章 小结与展望51-53
• 1 小结51
• 2 展望51-53
• 参考文献53-59
• 附录Ⅰ 荧光定量样品OD值59-60
• 附录Ⅱ qPCR计算结果60-61
• 附录Ⅲ 白花Ⅱ水仙离体快繁过程61-63
• 附录Ⅳ ‘云香水仙’离体快繁过程63-66
• 致谢66

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本文编号：303168