髓系肿瘤中miR-378基因5’侧翼区甲基化态势的临床研究

发布时间：2017-04-13 14:11

  本文关键词：髓系肿瘤中miR-378基因5’侧翼区甲基化态势的临床研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的研究造血系统髓系肿瘤急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)、慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)以及骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者miR-378基因5’侧翼区甲基化态势,并统计分析其临床相关性。方法应用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)技术检测AML患者miR-378基因表达水平,并用实时定量甲基化特异性PCR(real-time quantitative methylation-specific PCR,RQ-MSP)分别检测AML、CML、MDS患者miR-378基因5’侧翼区甲基化水平。亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing PCR)技术用来分析患者miR-378基因5’侧翼区的甲基化密度。结果造血系统髓系肿瘤中均存在不同程度的miR-378基因5’侧翼区低甲基化。(1)130例AML患者中54例(41.5%)为miR-378低甲基化,甲基化改变与患者的性别、年龄、外周血血小板计数、血红蛋白含量、白细胞计数、原始细胞比例均无关(P0.05)。低甲基化频率与患者的FAB、WHO分型及染色体危险度分组不相关(P0.05),但在FAB分型中,M2型患者的低甲基化程度明显高于其他组。此外,miR-378低甲基化与染色体分型有关,且t(8;21)易位患者存在程度较高的miR-378低甲基化改变。在AML患者中并未发现miR-378甲基化与表达相关,但THP-1细胞株经过去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-dC)处理后重新出现了表达上调和甲基化水平的下降,miR-378基因甲基化程度与完全缓解及总体生存时间(overall survival time,OS)无关(P0.05)。(2)52例CML患者中19例(36.5%)出现miR-378低甲基化,miR-378基因甲基化改变与患者性别、年龄、外周血血红蛋白含量、白细胞计数、血小板计数、BCR/ABL相对含量、染色体核型分组均无相关性(P0.05)。不同分期之间低甲基化频率急变期(2/7,28.5%)慢性期(15/40,38%))加速期(2/5,40%),但三组之间差异无统计学意义(P0.05)。(3)95例MDS患者中有20例(21.1%)存在miR-378低甲基化,miR-378基因甲基化改变与患者年龄、外周血白细胞计数、血小板计数、血红蛋白计数均无关(P0.05),但男性患者miR-378基因低甲基化阳性率(15/55,27.3%)明显高于女性患者(4/40,10.0%)(P=0.04);低甲基化频率与染色体核型危险度分组、WHO分型、FAB分组、IPSS分组无相关性(P0.05);生存分析显示在全部MDS患者和年龄小于60岁患者,miR-378低甲基化患者的OS均明显短于miR-378高甲基化患者(P=0.036,P=0.027)。此外,Cox多因素分析发现miR-378低甲基化是年龄小于60患者OS的独立预后影响因素之一。结论(1)MiR-378基因5’侧翼区低甲基化是急慢性髓系白血病中常见的分子事件;(2)在AML患者中miR-378低甲基化与染色体分型有关,且t(8;21)易位患者存在程度较高的miR-378低甲基化改变;(3)MiR-378低甲基化是60岁以下MDS患者预后不良的独立影响因素。
【关键词】：MiR-378基因 甲基化 AML CML MDS RQ-PCR RQ-MSP BSP
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.7;R551.3
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 英文缩略语13-16
• 第一章 引言16-26
• 1.1 微小RNA16-17
• 1.2 微小RNA与肿瘤17-19
• 1.3 微小RNA与表观遗传学调控19-20
• 1.4 DNA甲基化与髓系肿瘤20-26
• 1.4.1 AML22-23
• 1.4.2 CML23-24
• 1.4.3 MDS24-26
• 第二章 本论文研究的目的、方法及实验方案的设计、意义26-30
• 2.1 研究背景及目的26
• 2.2 研究方法及技术26-28
• 2.2.1 实时荧光定量PCR（RQ-PCR）26-27
• 2.2.2 实时定量甲基化特异性PCR（RQ-MSP）27-28
• 2.2.3 亚硫酸氢盐测序（Bisulfite sequencing PCR, BSP）28
• 2.3 实验方案的设计28-29
• 2.4 本研究的意义29-30
• 第三章 AML患者中miR-378基因 5’侧翼区甲基化研究30-54
• 3.1 材料30-32
• 3.1.1 研究对象30
• 3.1.2 主要仪器30-31
• 3.1.3 主要试剂31-32
• 3.1.4 引物32
• 3.2 方法32-41
• 3.2.1 细胞培养和药物处理32
• 3.2.2 骨髓单个核细胞的分离、全部mRNA及基因组DNA的提取32-33
• 3.2.3 DNA硫化修饰（Epitect? Bisulfite Kit修饰DNA）33-34
• 3.2.4 逆转录34
• 3.2.5 MiR-378基因表达的RQ-PCR检测34-35
• 3.2.6 MiR-378基因 5’侧翼区的RQ-MSP检测35-37
• 3.2.7 MiR-378基因 5’侧翼区BSP分析37
• 3.2.8 纯化回收PCR产物37-38
• 3.2.9 构建重组载体38
• 3.2.10 重组质粒转化38-39
• 3.2.11 重组质粒提取及测序、鉴定39-40
• 3.2.12 建立阳性模板40
• 3.2.13 细胞遗传学检测40-41
• 3.2.14 基因突变检测41
• 3.2.15 统计学处理41
• 3.3 结果41-51
• 3.3.1 RQ-MSP灵敏度、重复性、特异性41-43
• 3.3.2 MiR-378基因 5’侧翼区CpG岛43-44
• 3.3.3 对照组miR-378基因 5’侧翼区甲基化水平44-45
• 3.3.4 AML患者miR-378基因 5’侧翼区甲基化水平与临床相关性45-47
• 3.3.5 MiR-378基因甲基化态势与AML患者染色体核型分析47-48
• 3.3.6 AML患者miR-378基因 5’侧翼区甲基化密度分析48-49
• 3.3.7 MiR-378基因 5’侧翼区甲基化与表达相关性分析49-51
• 3.3.8 MiR-378基因 5’侧翼区甲基化态势与AML患者预后分析51
• 3.4 讨论51-54
• 第四章 CML患者中miR-378基因 5’侧翼区甲基化研究54-60
• 4.1 材料54
• 4.1.1 研究对象54
• 4.1.2 主要仪器54
• 4.1.3 主要试剂54
• 4.1.4 引物54
• 4.2 方法54-55
• 4.2.1 骨髓单个核细胞分离及基因组DNA制备54-55
• 4.2.2 DNA硫化修饰55
• 4.2.3 MiR-378基因 5’侧翼区RQ-MSP检测55
• 4.2.4 纯化回收PCR产物55
• 4.2.5 构建重组载体55
• 4.2.6 重组质粒转化55
• 4.2.7 重组质拉提取及测序、鉴定55
• 4.2.8 建立阳性模板55
• 4.2.9 细胞遗传学检查55
• 4.2.10统计学处理55
• 4.3 结果55-58
• 4.3.1 CML患者和对照组miR-378基因 5’侧翼区甲基化水平55-57
• 4.3.2 MiR-378基因 5’侧翼区甲基化水平与临床相关性57
• 4.3.3 不同分期CML患者miR-378基因 5’侧翼区甲基化水平57-58
• 4.4 讨论58-60
• 第五章 MDS患者中MiR-378基因 5’侧翼区甲基化研究60-70
• 5.1 材料60-61
• 5.1.1 研究对象60
• 5.1.2 主要仪器60
• 5.1.3 主要试剂60-61
• 5.1.4 引物61
• 5.2 方法61-62
• 5.2.0 BMMNCs 分离及基因组 DNA 制备61
• 5.2.1 DNA 硫化修饰61
• 5.2.2 mi R-378 基因 5’侧翼区 RQ-MSP 检测61
• 5.2.3 miR-378基因5’侧翼区 BSP 分析61
• 5.2.4 PCR 扩增产物纯化回收61
• 5.2.5 重组载体构建61
• 5.2.6 重组质粒转化61
• 5.2.7 重组质拉提取及测序、鉴定61
• 5.2.8 建立阳性模板61
• 5.2.9 细胞遗传学检查61
• 5.2.10 基因突变检测61-62
• 5.2.11 统计学处理62
• 5.3 结果62-68
• 5.3.1 MDS患者和对照组miR-378基因 5’侧翼区甲基化水平62-63
• 5.3.2 MiR-378基因 5’侧翼区甲基化水平与临床相关性63-65
• 5.3.3 MDS患者miR-378基因 5’侧翼区甲基化密度分析65
• 5.3.4 MiR-378基因 5’侧翼区甲基化态势与MDS患者预后分析65-68
• 5.4 讨论68-70
• 第六章 结论和展望70-71
• 6.1 主要结论70
• 6.2 展望70-71
• 参考文献71-82
• 致谢82-84
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文及其他科研成果84

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本文编号：303779