陆地棉抗旱抗衰老相关基因GhWRKY33的克隆与功能验证

发布时间：2021-02-14 03:16

　　棉花是重要的经济作物。许多生物胁迫、非生物胁迫以及早衰等因素严重影响棉花的产量和品质。WRKY转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,由一个或者两个W RKY保守结构域构成。前人研究发现,WRKY转录因子与植物应答盐碱、温度、离子等胁迫相关,也参与植物的衰老过程,但是在棉花中已知的参与叶片衰老过程的WRKY转录因子却了解甚少。课题组前期已经对陆地棉WRKY转录因子进行过比较全面的鉴定及分析,并且测定了一个棉花叶片衰老的转录组数据库,从中筛选到GhWRKY33基因,该基因在棉花衰老过程中和干旱胁迫下表达量显著上调。基于此,本研究从棉花中克隆得到了Gh WRKY33基因,并对其组织表达特性、不同诱导条件下的表达模式进行了研究,通过过表达技术分析并明确基因的功能,获得主要结果如下:1.从陆地棉品种中棉所10号中克隆得到GhWRKY33,其ORF全长为1533bp,编码一个含有510个含有氨基酸残基的蛋白,含有两个WRKY保守结构域和两个C2H2型锌指结构。对该基因氨基酸序列和进化关系等进行了生物信息学分析,发现该基因属于第Ⅰ类WRKY转录因子家族。2.构建了 35S::GhWRKY33-GF... 

【文章来源】：河北农业大学河北省

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表及中文对照
1 引言
    1.1 植物干旱研究进展
    1.2 植物衰老研究进展
    1.3 WRKY转录因子的分类及生物学功能
        1.3.1 WRKY参与非生物胁迫
        1.3.2 WRKY参与生物胁迫
        1.3.3 WRKY参与植物生长发育
        1.3.4 WRKY参与叶片衰老
    1.4 棉花WRKY转录因子研究进展
        1.4.1 棉花WRKY转录因子全基因组鉴定
        1.4.2 棉花WRKY转录因子的功能研究
    1.5 研究目的意义
2 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 试剂、载体及菌株
    2.2 试验方法
        2.2.1 材料的种植与处理
        2.2.2 棉花基因组DNA提取
        2.2.3 棉花总RNA的提取
        2.2.4 反转录合成cDNA
        2.2.5 引物设计
        2.2.6 GhWRKY33基因的克隆
        2.2.7 GhWRKY33基因的生物信息学分析
        2.2.8 载体构建
        2.2.9 阳性重组子质粒提取
        2.2.10 阳性重组子转化农杆菌
        2.2.11 侵染本氏烟草
        2.2.12 洋葱表皮细胞的的预培养
        2.2.13 GUS染色
        2.2.14 荧光定量PCR
        2.2.15 拟南芥遗传转化
        2.2.16 转基因拟南芥的筛选
        2.2.17 转基因拟南芥的表型观察
        2.2.18 转基因拟南芥的抗旱性鉴定及生理指标测定
3 结果与分析
    3.1 陆地棉GhWRKY33基因的克隆及生物信息学分析
        3.1.1 目的基因的克隆
        3.1.2 GhWRKY33的生物信息学分析
    3.2 GhWRKY33基因的亚细胞定位
        3.2.1 目的片段的克隆及载体构建
        3.2.2 亚细胞定位荧光信号观察
    3.3 GhWRKY33启动子序列的克隆及分析
        3.3.1 启动子序列的克隆及表达载体构建
        3.3.2 启动子的结构分析和功能预测
        3.3.3 启动子的启动活性分析
    3.4 GhWRKY33的表达模式分析
        3.4.1 GhWRKY33基因的组织特异性表达分析
        3.4.2 GhWRKY33在干旱和不同激素处理下的表达分析
    3.5 转GhWRKY33拟南芥的功能分析
        3.5.1 植物过表达载体的构建
        3.5.2 转基因拟南芥中GhWRKY33的表达分析
        3.5.3 转基因拟南芥的抗旱性鉴定
        3.5.4 GhWRKY33影响与干旱响应相关的基因表达
        3.5.5 转基因拟南芥衰老表型鉴定
        3.5.6 衰老相关基因的表达分析
4 讨论
    4.1 GhWRKY33通过激素信号传导调节植物抗旱和衰老
    4.2 GhWRKY33在植物抗旱和衰老中具有重要作用
    4.3 GhWRKY33的鉴定和结构特性分析
5 结论
参考文献
读期间发表的学术论文
作者简历
致谢
附件


【参考文献】：
期刊论文
[1]GhWRKY48负调控棉花对大丽轮枝菌的抗性[J]. 刘建芬,雷煜,张振楠,胡广,唐叶,张宁,司怀军,吴家和.  华北农学报. 2019(05)
[2]棉花WRKY22基因分离及其对黄萎病的抗性分析[J]. 雷煜,张振楠,胡广,刘建芬,唐叶,张宁,司怀军,吴家和.  华北农学报. 2018(06)
[3]陆地棉盐胁迫应答基因GhWRKY41的克隆与分析[J]. 苏莹,甄军波,张曦,王玉美,李乐,华金平.  中国农业大学学报. 2016(12)
[4]WRKY转录因子家族调控植物逆境胁迫响应[J]. 孙淑豪,余迪求.  生物技术通报. 2016(10)
[5]番茄WRKY基因家族的生物信息学分析[J]. 张红,姜景彬,许向阳,李景富.  分子植物育种. 2016(08)
[6]GhWRKY44基因在烟草中遗传转化及功能分析[J]. 赵曾强,韩泽刚,李会会,李潇玲,张析,张薇.  华北农学报. 2016(01)
[7]桃WRKY基因家族全基因组鉴定和表达分析[J]. 谷彦冰,冀志蕊,迟福梅,乔壮,徐成楠,张俊祥,周宗山,董庆龙.  遗传. 2016(03)
[8]Genome-wide analysis of the WRKY transcription factor gene family in Gossypium raimondii and the expression of orthologs in cultivated tetraploid cotton[J]. Caiping Cai,Erli Niu,Hao Du,Liang Zhao,Yue Feng,Wangzhen Guo.  The Crop Journal. 2014(Z1)
[9]氮肥对新疆棉花产量形成期叶片光合特性的调节效应[J]. 勾玲,闫洁,韩春丽,赵瑞海,张旺锋,杨新军.  植物营养与肥料学报. 2004(05)
[10]赤霉素和乙烯对香菜叶片衰老的影响[J]. 周相娟,姜微波,胡小松,周立刚.  北方园艺. 2003(03)

硕士论文
[1]棉花WRKY转录因子家族基因鉴定、表达分析和WRKY46功能研究[D]. 戴鹤.河北农业大学 2015



本文编号：3033026