TBC1D15基因糖代谢调节功能的研究
发布时间：2021-02-15 09:57
目的利用CRISPR/Cas9系统敲除L02和L6细胞的TBC1D15基因,从细胞水平上研究TBC1D15与糖代谢的关系,为新型降糖药物设计提供潜在靶标。方法首先针对大鼠Tbc1d15基因的CDS序列设计并构建5个包含sgRNA序列的pX459重组载体。通过MTT实验确定L02和L6细胞的最佳嘌呤霉素筛选浓度,随后用已有的pX462重组质粒转染L02细胞,用pX459重组质粒转染L6细胞,利用T7E1核酸内切酶检测敲除效率,用有限稀释法筛选出单克隆细胞株,然后利用Western Blotting和基因组PCR分别验证TBC1D15在蛋白水平和基因组水平的变化。在功能研究方面,通过2-NBDG葡萄糖荧光类似物培养,经流式细胞仪检测糖吸收情况。利用Western Blotting技术检测了胰岛素刺激下野生型和TBC1D15-/-细胞的GLUT4、Rab7和LC3B的表达变化。筛选能在1014 d杀死全部L02和L6细胞的最低G-418浓度,构建HA-GLUT4-EGFP表达载体,转染野生型和TBC1D15-/-L02细胞,筛...
【文章来源】：浙江理工大学浙江省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
内源性DNA修复机制[1]
图 1.2 GLUT4 结构图[30]Figure 1.2 Structural features of the insulin-regulated GLUT4萄糖转运蛋白的分布不同类型的细胞中，GLUT 蛋白的表达具有较大差异[27]。GLUT1 在所有细胞用来维持基础葡萄糖的摄取，GLUT2 主要表达在肝细胞和胰岛 β 细胞，GL中表达，GLUT5 表达在肠上皮和睾丸，GLUT6 在脾脏，白细胞和脑中均有是，GLUT8 定位在细胞质中的囊泡上，伴随着糖基化蛋白的降解，GLUT8溶酶体运输到细胞质中[31]。GLUT9 在肝脏和肾脏中表达，GLUT10 在肝脏和GLUT11 存在于肌肉中，GLUT12 在心脏和前列腺中表达。受胰岛素刺激4 主要在肌肉和脂肪组织表达，也在脑的特定区域表达，例如下丘脑，进行胰葡萄糖传感和代谢调节[32]。UT4 的转运过程
士学位论文 TBC1D15 基因糖代谢位到细胞膜上，而不是影响细胞内 GLUT4 的总量。运动也会使膜上，在响应运动和胰岛素刺激时，骨骼肌中某种分子开关平，但是这 2 种刺激激活这种分子开关的信号传导通路不同[33, 在进食后胰岛素丧失了促进糖摄取的功能，但是运动后 GLUTUT4 的分子开关在 2 型糖尿病患者的肌肉中还是完整的，而是这个原因，GLUT4 运输过程中的相关蛋白成为研究治疗 2 型糖化合物与相关蛋白作用，能在胰岛素信号缺失的情况下使 GL进葡萄糖的摄取[35]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9在基因治疗中的应用研究进展[J]. 黄佳杞,黄秦特,章国卫. 浙江医学. 2017(17)
[2]CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其在动物基因组定点修饰中的应用[J]. 周金伟,徐绮嫔,姚婧,余树民,曹随忠. 遗传. 2015(10)
硕士论文
[1]TBC1D15基因的敲除细胞系构建及其功能研究[D]. 程丹丹.浙江理工大学 2017
[2]蛋白激酶Akt生物学功能的初步研究[D]. 沈岚.第四军医大学 2005
本文编号：3034628
【文章来源】：浙江理工大学浙江省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
内源性DNA修复机制[1]
图 1.2 GLUT4 结构图[30]Figure 1.2 Structural features of the insulin-regulated GLUT4萄糖转运蛋白的分布不同类型的细胞中，GLUT 蛋白的表达具有较大差异[27]。GLUT1 在所有细胞用来维持基础葡萄糖的摄取，GLUT2 主要表达在肝细胞和胰岛 β 细胞，GL中表达，GLUT5 表达在肠上皮和睾丸，GLUT6 在脾脏，白细胞和脑中均有是，GLUT8 定位在细胞质中的囊泡上，伴随着糖基化蛋白的降解，GLUT8溶酶体运输到细胞质中[31]。GLUT9 在肝脏和肾脏中表达，GLUT10 在肝脏和GLUT11 存在于肌肉中，GLUT12 在心脏和前列腺中表达。受胰岛素刺激4 主要在肌肉和脂肪组织表达，也在脑的特定区域表达，例如下丘脑，进行胰葡萄糖传感和代谢调节[32]。UT4 的转运过程
士学位论文 TBC1D15 基因糖代谢位到细胞膜上，而不是影响细胞内 GLUT4 的总量。运动也会使膜上，在响应运动和胰岛素刺激时，骨骼肌中某种分子开关平，但是这 2 种刺激激活这种分子开关的信号传导通路不同[33, 在进食后胰岛素丧失了促进糖摄取的功能，但是运动后 GLUTUT4 的分子开关在 2 型糖尿病患者的肌肉中还是完整的，而是这个原因，GLUT4 运输过程中的相关蛋白成为研究治疗 2 型糖化合物与相关蛋白作用，能在胰岛素信号缺失的情况下使 GL进葡萄糖的摄取[35]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9在基因治疗中的应用研究进展[J]. 黄佳杞,黄秦特,章国卫. 浙江医学. 2017(17)
[2]CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其在动物基因组定点修饰中的应用[J]. 周金伟,徐绮嫔,姚婧,余树民,曹随忠. 遗传. 2015(10)
硕士论文
[1]TBC1D15基因的敲除细胞系构建及其功能研究[D]. 程丹丹.浙江理工大学 2017
[2]蛋白激酶Akt生物学功能的初步研究[D]. 沈岚.第四军医大学 2005
本文编号：3034628
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