变异链球菌基因诱导表达系统及其应用

发布时间：2021-02-17 06:35

　　基因表达系统在研究代谢途径、信号通路、基因表达调控等方面都起到重要作用。其被广泛的应用于生物、食品、工业以及医学领域,以原核生物细胞及真核生物细胞作为表达系统,进行目的基因序列的表达以生产蛋白疫苗、核酸疫苗和生物酶制剂等是近年来发酵工业的新型领域。诱导基因表达系统是一种特异性、高效率及剂量依赖性的系统,该系统已经成功的应用于酶、多肽、中间代谢物等表达产物的生产,对食品、医药、保健业和工业等领域大发展起到极大的推动作用。通过利用强启动子将克隆基因整合到染色体上,构建高效的诱导性表达载体,通过不同的诱导方法,实现外源蛋白的高效表达。目前,对于变异链球菌的诱导系统构建已有相关研究,但将该系统与转座系统相结合用于探究一些相关基因的功能等方面尚且不足。本论文以变异链球菌（Streptococcus mutans）UA159为研究对象,旨在构建一个适用于该菌的一个能够有效控制基因表达以及能与转座系统相结合的诱导型表达系统。主要研究结果如下:（1）在变异链球菌UA159中将转座元件与已有的两个木糖诱导系统S2和S1结合构建了两个转座载体 pLH475（pLH1 45::gyrAp::xylR::xy... 

【文章来源】：天津科技大学天津市

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２－１?ｐＳＥＴ４ｓ图谱??Ｆｉｇ．?２－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＳＥＴ４ｓ??

?天津科技大学硕士学位论文???３．１．３转座载体ｐＬＨ６３０构建??实验构建了用于转座载体ＰＬＨ６３０，通过一系列的ＰＣＲ分别以质粒ｐＬＨ４７５和质？??粒ｐＺＸ９为模板获得三个片段后再通过Ｇｏｌｄｅｎ?Ｇａｔｅ?Ｃｌｏｎｉｎｇ方法连接后转化及验证，?．??最终成功获得启动子由：ｃ＿ｙ／Ａｐ换成／洲ｐ的质粒ｐＬＨ６３０。构建图谱如下：??ｆ?ＰＬＨ４７５〕ｆ?－３０?Ｖ－??Ｖ?７９７９?ｂｐ?Ｖ?７９２９ｂｐ??ｓｐｃ－＾??图３－５载体ｐＬＨ６３０的构建流程图??Ｆｉｇ．?３－５?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐＬＨ４６３０??实验选用Ｐｒｉｍｅｒ?ＳＴＡＲ?ＤＮＡ?Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，以质粒ｐＬＨ４７５和ｐＺＸ９作为模板根据??上述２．２．９．Ｉ操作进行，由此得到的三个片段如图３－６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）所示，长度分别约为??４０５２、１５４、３７２９?ｂｐ。将ＰＣＲ获得三个片段按照Ｇｏｌｄｅｎ?Ｇａｔｅ?Ｃｌｏｎｉｎｇ方法进行连接后，??再按照上述２．２．７．６，?２．２．７．７进行操作，进行连接、化转，菌落ＰＣＲ验证，电泳结果??如图３－６?（ｄ）所示，１、２号条带与预期大小一致，对１、２号转化子提取质粒并且用Ｑｕｉｔ??５ａｍＨ?Ｉ和Ｑｕｉｔ?ＥｃｏＲ?Ｉ进行酶切验证，电泳结果如图３－６?（ｅ）所示，１、２号都有与预期??大小一致的条带，现象表明ＰＬＨ６３０构建完成。??１?２?Ｍ?１?２?Ｍ?Ｍ?１?２??（ａ）?（ｂ）?（ｃ）??２９??

?３结果与讨论???Ｍ?Ｎ?Ｐ?１?２?３?Ｍ?１?２??鍾蠢：＿漏＿議議??ＪＰ１?＾１??１〇〇ｂｆ＾－＾￡＾??（ｄ）?（ｅ）??图３－６转座载体ｐＬＨ６３０的构建结果??Ｆｉｇ．?３－６?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐＬＨ６３０??Ｍ：?ＤＮＡＬａｄｄｅｒ；?Ｎ：阴性对照；Ｐ：阳性对照；（ａ）质粒ｐＬＨ４７５为模板扩增片段丨；（ｂ）以??质粒ｐＺＸ９为模板扩增的包含／外的片段；（ｃ）以ＰＬＨ４７５为模板进行扩増的片段３；?（ｄ）?ｐＬＨ６３０??菌落ＰＣＲ验证；（ｅ）将菌落ＰＣＲ验证正确的转座子提取质粒进行酶切验证??实验中构建的质粒ＰＬＨ４７５与质粒ｐＬＨ６３０的区别是，前者的启动子为ｘｙ／Ａｐ后者??启动子为Ｗ／？ｐ，其启动子结构如下图３－７?（ａ）、３－７?（ｂ）所不；??Ａ?＼?＾?｜＼??——：ｓｅ?ｍ—??％?（ａ）??ｘｙＩＡ％??－＾Ｌｍ—■?丨圓：＇＇?（ｂ）??＾?ｌｉ－＂．…ｖ??ｖｘ－ｖ＇Ｘ＇－??图３－７质粒结构示意图??Ｆｉｇ．?３－７?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??（ａ）质粒ｐＬＨ４７５启动子结构；（ｂ）质粒ｐＬＨ６３０启动子结构??３０??

【参考文献】：
硕士论文
[1]赤藓糖醇对变异链球菌在蔗糖中生长、黏附及基因表达影响的实验研究[D]. 苏盟盟.福建医科大学 2017



本文编号：3037587