氨氧化酶基因文库构建和高活性氨氧化工程菌的筛选
发布时间：2021-02-17 03:38
随着现代工业、农业和养殖业高速发展,环境污染问题日益严重。据2018年中国环境状况公报报道,氮污染位于众多污染首位。人类活动对氮循环的干扰极大地加速了地球生态环境的变化,引发严重的氮循环失衡、氮污染加剧、温室气体排放增多等不良效应,及时有效地解决氮污染问题刻不容缓。微生物在治理氮污染等方面发挥了重要的作用,氨氧化是氮污染治理的重要环节,目前研究和应用的氨氧化菌主要是从环境中分离纯化的菌株,或者克隆某种单一微生物的氨氧化酶基因（amoA）构建其工程菌。为了进一步提高氨氧化菌（AOB）的筛选效率,本文构建了环境样品自养氨氧化菌群amo A基因文库,通过对重组子活性的筛选,获得高活性AmoA,进一步采用定向进化技术,构建amoA突变文库并筛选高活性AmoA重组子,将筛选到的amoA与羟胺氧化酶基因（hao）在宿主菌种共表达,以期获得高活性AOB。本研究的主要结果如下:（1）氨单加氧酶（AmoA）初筛体系的建立:以Pseudomonas（P.）aeruginosa ATCC9027的amoA,构建工程菌E.coli BL21（amoA）,建立了一种原位测定AmoA活性的方法,挑取重组子于96孔...
【文章来源】：华侨大学福建省
【文章页数】：88 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
技术路线图
192.3.4.4AmoA高通量活性筛选体系的确立在已经优化的溶菌酶浓度和溶菌酶作用时间下将96孔板中的细菌菌体破碎。再向每个孔中加入终浓度为100mg/L的NH4+-N，反应30min后，向其中依次加入10μL的乙酸-乙酸钠缓冲液，10μL的FAS使用液和10μL的邻菲罗啉溶液，摇匀静置40min后，用10mm比色皿，在510nm波长下测定其吸光值，根据标准曲线计算出羟胺的含量。2.4结果2.4.1重组菌E.coliBL21(amoA)的构建2.4.1.1基因组DNA和质粒pETDuet-1的检测参照细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取P.aeruginosaATCC9027基因组DNA。经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2.1(A)，图示显示目的条带大于15kb，可知成功提取到P.aeruginosaATCC9027基因组DNA，经超微量紫外分光光度计测得其浓度为265.4ng/μL，OD260/OD280比值为1.79，纯度符合要求，可用于下一步扩增目的基因。参照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取pETDuet-1质粒，结果如图2.1(B)。图2.1基因组DNA(A)和质粒载体pETDuet-1(B)的琼脂糖凝胶电泳检测图A：LaneM：DNAMarker15K；Lane1：基因组DNA；Lane2：阴性对照组；图BLaneM：DNAMarker2K；Lane1：质粒pETDuet-1；Lane2：阴性对照组。Fig.2.1DectectionofgenomicDNA(A)andpETDuet-1(B)byagarosegelelectrophoresis.A:LaneM,DNAMarker15K;Lane1,genomicDNA.Lane2,negativecontrol.B:LaneM,DNAMarker2K;Lane1,theextractedpETDuet-1plasmid.Lane2,negativecontrol.2.4.1.2amoA基因的扩增amoA基因PCR扩增结果如图2.2，结果显示Lane2-6在1000bp与2000bp之间出现了大小与目的基因amoA(1038bp)相符的单一条带。通过切胶回收目的
20条带，经超微量紫外分光光度计检测，得纯化回收后产物浓度分别为amoA：92.5ng/μL；OD260/OD280比值为1.7-1.9之间，符合后续的实验要求。图2.2amoA基因琼脂糖凝胶电泳检测Lane2-6：amoA基因PCR检测；LaneM：DNAMarkerDL2000；Lane1：阴性对照组；Fig.2.2DectectionofaimedamoAgenebyagarosegelelectrophoresis.Lane2-6,theamplifiedamoAgene;LaneM,DNAMarkerDL2000.Lane1,negativecontrol.2.4.1.3重组菌E.coliBL21(amoA)的构建目的基因amoA经双酶切后与质粒pETDuet-1经T4连接酶连接后转化至感受态细胞E.coliBL21中，复苏后取100μL于涂布于卡纳抗生素的LB平板上，37℃恒温培养12h，在含氨苄霉素培养皿上长出大量单菌落见，图2.3。图2.3涂布平板后E.coliBL21转化菌的生长情况Fig.2.3ThegrowthoftransformedE.coliBL21.2.4.1.4重组菌E.coliBL21(amoA)的筛选将双酶切的目的基因amoA与pETDuet-1质粒经T4连接酶连接后转化至感受态E.coliDH5α，经复苏后取100μL菌液涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37℃恒温过夜培养，挑取单菌落，通过菌落PCR和双酶切的方法对重组质粒进行鉴定并保种。菌落PCR结果如图所示2.4(A)，条带分别于目的基因大小相符，将阳性重组菌扩大培养，提取其质粒后进行双酶切验证，酶切结果如图2.4(B)。重组菌中的质粒经双酶切后，出现与线性质粒和目的基因amoA大小一致的两条条带。将连接成功的质粒pETDuet-1-amoA转化到表达菌株BL21中，成功构建重组菌E.coliBL21(pETDuet-1-amoA)。
本文编号：3037369
【文章来源】：华侨大学福建省
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
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192.3.4.4AmoA高通量活性筛选体系的确立在已经优化的溶菌酶浓度和溶菌酶作用时间下将96孔板中的细菌菌体破碎。再向每个孔中加入终浓度为100mg/L的NH4+-N，反应30min后，向其中依次加入10μL的乙酸-乙酸钠缓冲液，10μL的FAS使用液和10μL的邻菲罗啉溶液，摇匀静置40min后，用10mm比色皿，在510nm波长下测定其吸光值，根据标准曲线计算出羟胺的含量。2.4结果2.4.1重组菌E.coliBL21(amoA)的构建2.4.1.1基因组DNA和质粒pETDuet-1的检测参照细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取P.aeruginosaATCC9027基因组DNA。经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2.1(A)，图示显示目的条带大于15kb，可知成功提取到P.aeruginosaATCC9027基因组DNA，经超微量紫外分光光度计测得其浓度为265.4ng/μL，OD260/OD280比值为1.79，纯度符合要求，可用于下一步扩增目的基因。参照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取pETDuet-1质粒，结果如图2.1(B)。图2.1基因组DNA(A)和质粒载体pETDuet-1(B)的琼脂糖凝胶电泳检测图A：LaneM：DNAMarker15K；Lane1：基因组DNA；Lane2：阴性对照组；图BLaneM：DNAMarker2K；Lane1：质粒pETDuet-1；Lane2：阴性对照组。Fig.2.1DectectionofgenomicDNA(A)andpETDuet-1(B)byagarosegelelectrophoresis.A:LaneM,DNAMarker15K;Lane1,genomicDNA.Lane2,negativecontrol.B:LaneM,DNAMarker2K;Lane1,theextractedpETDuet-1plasmid.Lane2,negativecontrol.2.4.1.2amoA基因的扩增amoA基因PCR扩增结果如图2.2，结果显示Lane2-6在1000bp与2000bp之间出现了大小与目的基因amoA(1038bp)相符的单一条带。通过切胶回收目的
20条带，经超微量紫外分光光度计检测，得纯化回收后产物浓度分别为amoA：92.5ng/μL；OD260/OD280比值为1.7-1.9之间，符合后续的实验要求。图2.2amoA基因琼脂糖凝胶电泳检测Lane2-6：amoA基因PCR检测；LaneM：DNAMarkerDL2000；Lane1：阴性对照组；Fig.2.2DectectionofaimedamoAgenebyagarosegelelectrophoresis.Lane2-6,theamplifiedamoAgene;LaneM,DNAMarkerDL2000.Lane1,negativecontrol.2.4.1.3重组菌E.coliBL21(amoA)的构建目的基因amoA经双酶切后与质粒pETDuet-1经T4连接酶连接后转化至感受态细胞E.coliBL21中，复苏后取100μL于涂布于卡纳抗生素的LB平板上，37℃恒温培养12h，在含氨苄霉素培养皿上长出大量单菌落见，图2.3。图2.3涂布平板后E.coliBL21转化菌的生长情况Fig.2.3ThegrowthoftransformedE.coliBL21.2.4.1.4重组菌E.coliBL21(amoA)的筛选将双酶切的目的基因amoA与pETDuet-1质粒经T4连接酶连接后转化至感受态E.coliDH5α，经复苏后取100μL菌液涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37℃恒温过夜培养，挑取单菌落，通过菌落PCR和双酶切的方法对重组质粒进行鉴定并保种。菌落PCR结果如图所示2.4(A)，条带分别于目的基因大小相符，将阳性重组菌扩大培养，提取其质粒后进行双酶切验证，酶切结果如图2.4(B)。重组菌中的质粒经双酶切后，出现与线性质粒和目的基因amoA大小一致的两条条带。将连接成功的质粒pETDuet-1-amoA转化到表达菌株BL21中，成功构建重组菌E.coliBL21(pETDuet-1-amoA)。
本文编号：3037369
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