幽门螺杆菌可塑区virB2和virB11基因生物学功能研究

发布时间：2021-02-22 21:45

　　目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是已知与人类胃及十二指肠疾病相关最重要的细菌,virB2和virB11为幽门螺杆菌可塑性区IV型分泌系统tfs3a基因簇结构基因,它们的生物学功能特性在目前可获得的文献中很少报道。为此,本论文以以H.pylori临床分离株H.pylori WH-21可塑性区virB2和virB11基因及其蛋白作为研究对象,通过分子生物学、免疫学和生物信息学进一步研究virB2和virB11基因及其编码产物,为进一步研究H.pylori致病机制及诊断和治疗等奠定基础。方法:1.Karmali培养基微需氧环境中培养H.pylori WH-21菌株。2.PCR法构建virB11基因的原核表达载体,IPTG法诱导宿主表达,Ni²⁺-NTA法纯化融合蛋白,利用尿素梯度透析复性蛋白免疫家兔制备抗重组VirB11蛋白多克隆抗血清。3.Western blotting法检测VirB11蛋白的亚细胞定位,免疫共沉淀实验和质谱分析方法进行VirB11蛋白的互作蛋白分析。4.将不同浓度的纯化的VirB11蛋白与人正常胃上皮细胞GES-1共培养,并测定共培养后上清液中的IL-8含量。5.合成VirB2蛋白,与正常胃上皮细胞GES-1共培养进行MTT实验,用小鼠制备多克隆抗体,测定抗体效价。6.使用生物信息学软件分析virB2和virB11基因编码蛋白的理化性质、细胞定位、信号肽及空间结构等。结果:1.使用H.pylori WH-21菌株为模板,成功获得了长度为940bp的virB11基因的全长片段。2.通过构建virB11基因的原核表达载体pET28a-virB11,诱导纯化获得VirB11蛋白,免疫雄兔,获得了效价为1:16000的兔抗-VirB11多克隆抗体。3.测定了VirB11蛋白和GES-1共培养的上清液IL-8浓度,结果表明VirB11蛋白的细胞毒性有浓度依赖性,在一定程度上说明宿主炎症的产生与VirB11蛋白的存在有一定的关系。4.通过免疫印迹法、质谱等分析方法,利用免疫雄兔制备的VirB11蛋白的多克隆抗体对VirB11蛋白进行研究的结果表明,VirB11定位于细胞内膜,与ATP合酶β亚基（ATP syntheses subunit beta）、异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenate）、胞液氨基肽酶（cytosol aminopeptidase）和F0F1ATP合酶α亚基（F0F1 ATP syntheses subunit alpha）和苹果酸:醌氧化还原酶（malate:quinone oxidoreductase）等存在相互作用。5.利用合成的VirB2蛋白获得了鼠抗-VirB2多克隆抗体,明确了VirB2蛋白是一种有浓度依赖性细胞毒作用的蛋白。6.生物学软件分析显示,virB11基因编码的蛋白质VirB11蛋白的等电点为8.46,VirB11蛋白由313个氨基组成,它的分子量为36kDa,属于亲水性稳定蛋白,空间结构呈六聚体通道状,进一步证实VirB11蛋白参与ATP代谢的功能。virB2基因编码的蛋白质VirB2蛋白的等电点为9.56,VirB2蛋白由313个氨基组成,它的分子量为11kDa,但是它同VirB11蛋白不一样,属于疏水性稳定蛋白。结论:1.通过生物学软件分析,明确了VirB2蛋白是疏水性的稳定蛋白而VirB11蛋白则是一种亲水性的稳定性蛋白。2.明确了VirB11定位于细胞内膜,与ATP合酶β亚基（ATP syntheses subunit beta）、异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase）、胞液氨基肽酶（cytosol aminopeptidase）和F0F1ATP合酶α亚基（F0F1 ATP syntheses subunit alpha）和苹果酸:醌氧化还原酶（malate:quinone oxidoreductase）等存在相互作用。进一步证实了VirB11蛋白的ATP代谢相关性。3.明显提示VirB11蛋白与细胞分泌IL-8及组织炎症的发生有关。4.明确了VirB2蛋白的抗原性以及浓度依赖细胞毒的作用。 

【文章来源】：大连医科大学辽宁省

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
前言
    参考文献
第一部分 H.pylori virB11 基因功能研究
    （一）材料和方法
        1 材料
            1.1 实验菌株和载体
            1.2 主要试剂
            1.3 主要溶液的配制
            1.4 主要仪器
        2 方法
            2.1 H.pylori的培养与鉴定
            2.2 H.pylori DNA的提取
            2.3 设计合成virB11 基因的引物
            2.4 PCR克隆virB11 基因
            2.5 PCR产物的胶回收
            2.6 制备E.coli DH5α感受态
            2.7 virB11 基因的T-A连接反应
            2.8 连接产物转化E.coli DH5α感受态细菌
            2.9 virB11 重组质粒的筛选和提取
            2.10 构建、鉴定virB11 重组原核表达的质粒
            2.11 VirB11 融合蛋白的诱导表达和纯化
            2.12 制备VirB11 蛋白的多克隆抗体
            2.13 重组VirB11 蛋白的多克隆抗体效价测定
            2.14 H.pylori分离组分和亚细胞定位
            2.15 VirB11 蛋白的互作蛋白分析
            2.16 virB11 基因推导编码产物的获得及生物信息学分析
            2.17 免疫共沉淀中VirB11 蛋白及互作蛋白的验证
            2.18 VirB11 蛋白与GES-1 细胞共培养上清液的IL-8 检测
    （二）结果
        1.1 H.pylori WH-21 菌株的分离培养与鉴定鉴定
        1.2 H.pylori virB11 基因片段的PCR扩增
        1.3 virB11 基因的克隆与鉴定
        1.4 构建并分析virB11 基因重组表达质粒
        1.5 VirB11 重组蛋白的诱导表达及鉴定
        1.6 纯化VirB11 重组蛋白与测定抗体效价
        1.7 定位VirB11 蛋白在细胞内的位置
        1.8 分析VirB11 蛋白的互作蛋白
        1.9 分析VirB11 蛋白的理化特性
        1.10 预测VirB11 蛋白信号肽和跨膜区
        1.11 预测VirB11 蛋白二级结构
        1.12 VirB11 蛋白卷曲螺旋的预测分析
        1.13 VirB11 蛋白三维结构预测
        1.14 检测共培养上清液中IL-8的浓度
    （三）讨论
    （四）结论
    （五）参考文献
第二部分 H.pylori virB2 基因功能的研究
    （一）材料和方法
        1 材料
            1.1 合成VirB2 蛋白
            1.2 主要试剂
            1.3 主要溶液配制
            1.4 主要仪器
        2 方法
            2.1 VirB2 蛋白的生物信息学分析
            2.2 VirB2 蛋白与GES-1 细胞共培养及MTT实验
            2.3 VirB2 蛋白的多克隆抗体制备
            2.4 VirB2 蛋白的多克隆抗体效价测定
    （二）结果
        1.1 VirB2 蛋白的理化特性分析
        1.2 VirB11 蛋白信号肽和跨膜区的预测
        1.3 VirB11 蛋白二级结构的预测
        1.4 VirB11 蛋白卷曲螺旋的预测分析
        1.5 VirB11 蛋白三维结构预测
        1.6 VirB2 蛋白与GES-1 细胞共培养及MTT实验分析
        1.7 VirB2 蛋白的多克隆抗体效价测定
    （三）讨论
    （四）结论
    （五）参考文献
综述 幽门螺杆菌毒力因子的相关研究
    参考文献
攻读学位期间发表文章情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]How antibiotic resistances could change Helicobacter pylori treatment:A matter of geography?[J]. Enzo Ierardi,Floriana Giorgio,Giuseppe Losurdo,Alfredo Di Leo,Mariabeatrice Principi.  World Journal of Gastroenterology. 2013(45)
[2]利用亚细胞组分蛋白分离技术有效提取细胞骨架及其相关蛋白[J]. 蔡贞,熊石龙,周园,籍会彩,向春艳,郑磊.  南方医科大学学报. 2013(05)
[3]幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统Cag3基因的克隆表达及其质谱鉴定[J]. 刘俊,陈德玉,赵建忠,王明义,邵世和,戴东方.  江苏医药. 2013(03)
[4]蛋白质亚细胞定位的生物信息学研究[J]. 张松,黄波,夏学峰,孙之荣.  生物化学与生物物理进展. 2007(06)
[5]幽门螺杆菌napA基因原核表达系统构建及其表达产物的免疫性和致炎作用[J]. 王媛,严杰,毛亚飞.  中华微生物学和免疫学杂志. 2005(02)
[6]幽门螺杆菌临床菌株尿素酶B亚单位原核表达系统的构建及其重组蛋白免疫性的鉴定[J]. 陈喆,严杰,毛亚飞,钊守凤.  浙江大学学报(医学版). 2003(01)
[7]大肠杆菌His6融合表达载体及其表达产物的一步纯化[J]. 陈长征,黄华,龚健,夏其昌,的伯良,王应睐.  生物化学与生物物理学报. 1996(05)

博士论文
[1]胃十二指肠疾病高发区幽门螺杆菌毒力分析及dupA（2499）基因功能研究[D]. 王明义.江苏大学 2014



本文编号：3046591