叶酸缺乏对小鼠精原细胞基因组稳定性和纺锤体组装检查点相关蛋白基因表达的影响

发布时间：2021-03-01 00:44

　　叶酸（Folic acid,FA）是机体一碳代谢循环中重要的甲基供体,在DNA合成、稳定性及修复中起关键作用。FA缺乏会导致DNA碱基错配、缺失、DNA链和染色体断裂等基因组不稳定性（Genomic instability,GIN）的发生。纺锤体组装检查点（Spindle assembly checkpoint,SAC）作为细胞有丝分裂中期与后期之间存在的一种安全监督机制,作用是确保染色体精确分配到子代细胞,防止非整倍体细胞的产生。精子的质量和密度对男性生殖至关重要,不育患者的精子质量差、密度低,并且精子非整倍体数目明显增加,非整倍体会促进GIN的发生。FA缺乏是否对SAC产生影响,SAC在叶酸缺乏导致基因组不稳定性中扮演者什么角色少有报道。本文旨在探讨FA缺乏对小鼠精原细胞（GC-1spg）基因组稳定性和SAC相关蛋白基因表达的影响,初步探讨FA缺乏对生殖细胞基因组稳定性影响的机制。采用CCK-8、胞质分裂阻断微核细胞组分析（cytokinesis-block micronucleus cytome assay,CBMN-cyt）、流式细胞术、荧光定量PCR、Western bolt... 

【文章来源】：蚌埠医学院安徽省

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

叶酸的主要代谢途径Figure1.1Themajormetabolicpathwaysoffolicacid

11图3.2CBMN-Cyt实验中三类CIN指标的显微图A.双核细胞BMNC.NPBD.NBudFigure3.2MicrographsofthreetypesofCINindicatorsinCBMN-cytexperimentA.Dual-corecellsB.MNC.NPBD.NBud因此，本课题为研究FA缺乏对小鼠精原细胞基因组稳定性以及其对SAC的影响，结合文献报道[24]和课题组前期的研究，选用DMEM高糖液体培养基（无FA）和FA粉末进行调配，将FA浓度设置为四组，分别是无FA组（0nmol/L）、20nmol/L组、200nmol/L组和2000nmol/L组，选取小鼠精原细胞GC-1spg作为受试细胞株，用荧光定量PCR法分析两周后SAC基因mRNA表达变化，比较不同FA浓度对小鼠精原细胞SAC转录表达影响；用westernblotting分析SAC蛋白表达变化，比较不同FA浓度对小鼠精原细胞SAC蛋白表达影响；用CBMN-Cyt法分析不同浓度FA对小鼠精原细胞CIN频率的变化，了解基因组稳定性情况；最后结合SAC的表达情况，从基因组损伤层面辅助分析不同FA浓度下SAC的调控机制,同时对SAC基因甲基化表达情况进行预测，为以后其分子机制的研究奠定基矗

28第4章实验结果4.1叶酸缺乏会引起细胞形态异常随着培养时间的增加，除正常对照组外，其他各组细胞生长速度逐渐减慢。培养两周时后，与正常对照组相比，200nmol/L组形态未出现较大差异，20nmol/L和0nmol/L组细胞体积增大，细胞轮廓不清晰，形态不规则，尤其是0nmol/L组现象更加明显，之后细胞几乎停止增长（图4.1）。实验组前期研究结果显示：GC-1spg细胞经过连续两周叶酸缺乏培养，便可以构建出细胞叶酸缺乏模型。图4.1100x倒置显微镜下各组细胞形态A.2000nmol/L组B.200nmol/L组C.20nmol/L组D.0nmol/L组Figure4.1Cellmorphologyofeachgroupunder100xinvertedmicroscopeA.200nmol/LgroupB.2000nmol/LgroupC.200nmol/LgroupD.0nmol/Lgroup4.2叶酸缺乏对GC-1spg细胞活性的影响结合实验组前期研究结果我们发现GC-1spg细胞在无叶酸状态下连续培养两周后，细胞增殖速度严重下降，通过预实验条件摸索，确定了CCK-8测定时间，

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3056694