罗伊氏乳杆菌醇脱氢酶的克隆表达及酶学性质研究
发布时间：2021-03-02 20:09
醇脱氢酶（ADHs,E.C.1.1.1.1）属于氧化还原酶,能以NAD（P）H为辅酶,催化醇与相应的醛、酮相互转化。该酶在醇类代谢途径中起重要作用,常具有高立体选择性和广泛底物谱,因而被普遍应用于医药研究、化工生产和食品领域。本论文对罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri DSM20016中的5种醇脱氢酶进行了克隆表达,并优化了诱导条件,研究了酶学性质,为其影响奶酪芳香气味的体内验证奠定了分子生物学基础。主要研究结果如下:（1）本文成功克隆了 5个来自L.reutreri DSM20016的醇脱氢酶基因（adh-1、adh-2、adh-3、adh-4和adh-5）,分别连接到质粒 pRSFDuet-1 上,并在Escheria coli BL21（DE3）中表达。5 种 ADHs 预测分子量分别为 37.6kDa、37.8 kDa、35.8 kDa、36.0kDa 和39.0 kDa,其保守结构域分析显示这5种ADHs属于中链脱氢酶家族。经过酶活验证,发现5种ADHs对影响奶酪风味的庚醛均有一定活性。（2）本文优化了醇脱氢酶重组菌的诱导条件,得到重组菌的最适诱导条件:诱...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
ADHs催化酮的不对称还原反应
江南大学硕士学位论文18(e)图3-1ADHs的保守结构域Fig.3-1ConserveddomainsofADHs注：ADH-1(a)，ADH-2(b)，ADH-3(c)，ADH-4(d)，ADH-5(e).3.1.2ADHs的分子克隆根据Primer5.0软件设计的引物，对L.reuteriDSM20016中的ADHs基因进行PCR扩增，得到的PCR产物以1%的琼脂糖凝胶电泳验证，如图3-2所示，结果显示克隆片段与预期基因片段大小符合。将PCR产物和pRSFDuet-1质粒纯化后，用SacI和BamHI在37°C酶切1h。酶切产物经过纯化后与pRSFDuet-1质粒连接，16°C连接12h。随后转入E.coliDH5α感受态，涂布在LB抗性平板（Kanar）上进行过夜培养。挑取单菌落进行菌落PCR验证，结果如图3-3所示，可以看到5个ADHs均有阳性克拢验证正确的转化子接入液体LB液体培养基中继续培养，另外提取转化子质粒，用SacI和BamHI进行双酶切验证，结果显示酶切后获得基因片段约为1kb，与之前预测基因大小一致。为了进一步保证重组质粒准确性，将经过酶切验证的转化子进行序列测定，当测序拼接得到的序列与NCBI上获得的一致，说明目的基因成功连接到pRSFDuet-1质粒上。图3-2目的基因的PCR产物Fig.3-2PCRproductsoftargetgenesM:DL2000DNAMarker;1:adh-1;2:adh-2;3:adh-3;4:adh-4;5:adh-5.
第三章结果与讨论19图3-3菌落PCR鉴定图Fig.3-3VerificationofcolonyPCRM:DL2000DNAMarker;1-6为ADH-1；7-12为ADH-2；13-18为ADH-3；19-24为ADH-4；25-28为ADH-5。3.1.3ADHs的诱导表达重组大肠杆菌诱导表达后，8000×g离心5min，超声波破碎后进一步得到上清液。通过蛋白电泳分析破碎后的上清液，发现有明显的蛋白质特征条带出现，如图3-4。利用在线网站（http://web.expasy.org/protparam/）分析5个ADHs序列，得到相关分子大小的信息，五个ADHs均在350aa左右，符合一般锌依赖型ADHs的特性（表3-1）。从图3-4中可以看到目的蛋白表达水平各不相同，ADH-1、ADH-2和ADH-3的蛋白表达量较高。五个ADHs的分子量大小范围均在35~39kDa，与报道的大多数锌依赖型ADHs分子大小一致[70,71]。按照2.2.10中酶活检测方法，测定重组蛋白的粗酶活性，结果表明5个ADHs均对庚醛有一定活性，ADH-1到ADH-5粗酶活依次为0.78U·mL-1、0.45U·mL-1、0.23U·mL-1、0.49U·mL-1、0.56U·mL-1。表3-1重组蛋白分子大小Table3-1Molecularofrecombinantprotein酶名称氨基酸数目（aa）预测大小（kDa）12%SDS-PAGE显示大小（kDa）ADH-135137.638ADH-233637.838ADH-334835.836ADH-434236.036ADH-536839.039
【参考文献】：
期刊论文
[1]脂肪肝的研究进展[J]. 朱复生,杨红岩,秦玉杰. 内蒙古中医药. 2013(25)
[2]国内解酒制品研究进展[J]. 解傲,赵恕. 中国微生态学杂志. 2012(12)
[3]明胶载体固定化乙醇脱氢酶技术研究[J]. 毛跟年,李鑫,郭倩,瞿建波,李丽维. 中国酿造. 2010(11)
[4]连续监测法测定乙醇脱氢酶及其对肝脏疾病的诊断意义[J]. 孙阳,吕健宏,陈环. 国外医学(临床生物化学与检验学分册). 2005(06)
[5]醇脱氢酶结构和作用机理研究进展[J]. 许松伟,姜忠义,吴洪. 有机化学. 2005(06)
[6]水相中酵母细胞催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原反应[J]. 杨忠华,姚善泾. 催化学报. 2004(06)
[7]乙醇脱氢酶3的遗传多态性对摄入乙醇唾液和全血中乙醛含量的影响[J]. 李俊杰. 中国药理学与毒理学杂志. 2004(01)
[8]柿饼加工中脱涩和反涩机理的研究[J]. 张海生,陈锦屏. 食品工业科技. 2003(12)
[9]酵母乙醇脱氢酶电极的研究[J]. 吕跃钢,王际彰,张利平,张维成. 微生物学通报. 1997(04)
本文编号：3059871
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
ADHs催化酮的不对称还原反应
江南大学硕士学位论文18(e)图3-1ADHs的保守结构域Fig.3-1ConserveddomainsofADHs注：ADH-1(a)，ADH-2(b)，ADH-3(c)，ADH-4(d)，ADH-5(e).3.1.2ADHs的分子克隆根据Primer5.0软件设计的引物，对L.reuteriDSM20016中的ADHs基因进行PCR扩增，得到的PCR产物以1%的琼脂糖凝胶电泳验证，如图3-2所示，结果显示克隆片段与预期基因片段大小符合。将PCR产物和pRSFDuet-1质粒纯化后，用SacI和BamHI在37°C酶切1h。酶切产物经过纯化后与pRSFDuet-1质粒连接，16°C连接12h。随后转入E.coliDH5α感受态，涂布在LB抗性平板（Kanar）上进行过夜培养。挑取单菌落进行菌落PCR验证，结果如图3-3所示，可以看到5个ADHs均有阳性克拢验证正确的转化子接入液体LB液体培养基中继续培养，另外提取转化子质粒，用SacI和BamHI进行双酶切验证，结果显示酶切后获得基因片段约为1kb，与之前预测基因大小一致。为了进一步保证重组质粒准确性，将经过酶切验证的转化子进行序列测定，当测序拼接得到的序列与NCBI上获得的一致，说明目的基因成功连接到pRSFDuet-1质粒上。图3-2目的基因的PCR产物Fig.3-2PCRproductsoftargetgenesM:DL2000DNAMarker;1:adh-1;2:adh-2;3:adh-3;4:adh-4;5:adh-5.
第三章结果与讨论19图3-3菌落PCR鉴定图Fig.3-3VerificationofcolonyPCRM:DL2000DNAMarker;1-6为ADH-1；7-12为ADH-2；13-18为ADH-3；19-24为ADH-4；25-28为ADH-5。3.1.3ADHs的诱导表达重组大肠杆菌诱导表达后，8000×g离心5min，超声波破碎后进一步得到上清液。通过蛋白电泳分析破碎后的上清液，发现有明显的蛋白质特征条带出现，如图3-4。利用在线网站（http://web.expasy.org/protparam/）分析5个ADHs序列，得到相关分子大小的信息，五个ADHs均在350aa左右，符合一般锌依赖型ADHs的特性（表3-1）。从图3-4中可以看到目的蛋白表达水平各不相同，ADH-1、ADH-2和ADH-3的蛋白表达量较高。五个ADHs的分子量大小范围均在35~39kDa，与报道的大多数锌依赖型ADHs分子大小一致[70,71]。按照2.2.10中酶活检测方法，测定重组蛋白的粗酶活性，结果表明5个ADHs均对庚醛有一定活性，ADH-1到ADH-5粗酶活依次为0.78U·mL-1、0.45U·mL-1、0.23U·mL-1、0.49U·mL-1、0.56U·mL-1。表3-1重组蛋白分子大小Table3-1Molecularofrecombinantprotein酶名称氨基酸数目（aa）预测大小（kDa）12%SDS-PAGE显示大小（kDa）ADH-135137.638ADH-233637.838ADH-334835.836ADH-434236.036ADH-536839.039
【参考文献】：
期刊论文
[1]脂肪肝的研究进展[J]. 朱复生,杨红岩,秦玉杰. 内蒙古中医药. 2013(25)
[2]国内解酒制品研究进展[J]. 解傲,赵恕. 中国微生态学杂志. 2012(12)
[3]明胶载体固定化乙醇脱氢酶技术研究[J]. 毛跟年,李鑫,郭倩,瞿建波,李丽维. 中国酿造. 2010(11)
[4]连续监测法测定乙醇脱氢酶及其对肝脏疾病的诊断意义[J]. 孙阳,吕健宏,陈环. 国外医学(临床生物化学与检验学分册). 2005(06)
[5]醇脱氢酶结构和作用机理研究进展[J]. 许松伟,姜忠义,吴洪. 有机化学. 2005(06)
[6]水相中酵母细胞催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原反应[J]. 杨忠华,姚善泾. 催化学报. 2004(06)
[7]乙醇脱氢酶3的遗传多态性对摄入乙醇唾液和全血中乙醛含量的影响[J]. 李俊杰. 中国药理学与毒理学杂志. 2004(01)
[8]柿饼加工中脱涩和反涩机理的研究[J]. 张海生,陈锦屏. 食品工业科技. 2003(12)
[9]酵母乙醇脱氢酶电极的研究[J]. 吕跃钢,王际彰,张利平,张维成. 微生物学通报. 1997(04)
本文编号：3059871
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