β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆表达及其合成氨基寡糖技术研究
发布时间：2021-03-02 19:24
以几丁寡糖为代表的氨基寡糖具有丰富的生物活性,被应用于食品、医药和农业等多个领域。几丁寡糖的传统制造工艺主要借助于化学法、物理法和酶法降解几丁质,但传统制备方法存在以下瓶颈问题:（1）几丁质制备中脱盐、脱蛋白环节需要引入大量强酸、强碱,后处理的环保压力巨大;（2）水解法制备所得几丁寡糖产物聚合度不可控、目前规模化生产只能得到几丁二糖。针对上述问题,本研究旨在发掘具有逆水解/转糖苷潜力的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,以N-乙酰氨基葡萄糖为原料酶法逆向合成氨基寡糖,从而实现氨基寡糖的酶法绿色生物制造。首先,从基因组数据库中筛选得到了 3个细菌（Bacillus amyloliquefaciens、Enterococcus faecalis和Lactobacillus casei）来源的潜在β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因BaNagase、EfNagase和LcNagase。通过序列进化分析确定BaNagase归属于糖苷水解酶3家族,EfNagase和LcNagase均属于糖苷水解酶20家族。从微生物基因组DNA中克隆得到目的基因,并通过大肠杆菌表达系统成功异源重组表达、纯化得到以上3种重组酶,...
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．３几丁质在真菌和昆虫中的合成途径??Ｆｉｇ?１．３?Ｔｈｅ?ｃｈｉｔｉｎ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐａｔｈｗａｙ?ｉｎ?ｆｕｎｇｉ?ａｎｄ?ｉｎｓｅｃｔｓ??（２）糖苷水解酶??
葡萄糖胺?ｅ°Ａ??图１．３几丁质在真菌和昆虫中的合成途径??Ｆｉｇ?１．３?Ｔｈｅ?ｃｈｉｔｉｎ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐａｔｈｗａｙ?ｉｎ?ｆｕｎｇｉ?ａｎｄ?ｉｎｓｅｃｔｓ??（２）糖苷水解酶??糖苷水解酶（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ?ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，ＧＨ）是一类催化水解糖链中特定糖苷键的糖苷??酶。ＣＡＺｙ数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ）根据蛋白质序列进化关系将其分为１００多个家??族。糖作水解酶根据催化机制的差别又可将其分为反转型糖苷水解酶（ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ?ｅｎｚｙｍｅｓ）??和保留型糖苷水解酶（ｒｅｔａｉｎｉｎｇ?ｅｎｚｙｍｅｓ），具体作用方式如图１．４所示。从保留型糖苷??７ｊＣ解酶的反应机制中我们知道除了水解活性，其还具有转糖甘（ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，?ＴＧ）??潜力：在保留型糖苷水解酶的反应中将形成糖基－酶中间体，若被另一糖分子攻击，则??发生转糖苷反应。转糖苷催化机制也可用于合成特定的低聚糖，目前已被应用于不少低??聚糖的生产中，例如，低聚果糖以蔗糖作为底物，利用（３－Ｄ－呋喃果糖苷酶可大量得到；??低聚半乳糖也可以乳糖为底物，用Ｐ－半乳糖苷酶催化合成；类似地，在右旋糖酐、低聚??异麦芽糖和环糊精等的酶法合成都得到了应用［４３￣４４］。类似的还有报道利用几丁质酶的转??糖苷活性来合成几丁寡糖。其中沙雷氏菌、米曲霉和烟曲霉等来源的ＧＨ１８家族几丁质??酶的转糖苷活性的研究报道较多
被利用于寡糖合成的反应中。糖苷合成酶一般利用氟代糖、硝基苯基糖苷作为糖基供体，??４－甲基伞形酮或硝基苯基修饰的糖苷做为受体。根据作用机制不同，糖苷合成酶也可分??为反转型和保留型两类（图１．５）。而且由于糖苷合成酶丧失水解活性，合成的寡糖产物??不会被再次水解，则可使产率得到提升。??产Ｏ?〇?Ｌ??．ＵＨ?（）丄０?０Ｍ?（＼?１，０?°??一?ａ?ｅｔ?Ｖ．１Ｉ?ｌ〇Ｈ?■??ｋ?（ｙＨ?ｆ?Ｙ?ｆ??Ｊｎｚ?ｌ?ｌ?Ｅｔ１ｓ２?Ｅｎｘ??（ｂ）?Ｅｎｚ??°＾°?｛〇Ｈ?ＨｆＡ〇??（丨Ｘ＾〇Ｒ??Ｆ?Ｖ〇ｆ?Ｉ??Ｅｎｚ?Ｅｎｚ??图１．５以ａ－氟代糖为糖基供体的反转型糖苷合成酶（ａ）和保留型糖苷合成酶（ｂ）的作用机制…Ｉ??Ｆｉｇ?１．５?Ｆ＾ｅａｃｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ?ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ?（ａ）?ａｎｄ?ｒｅｔａｉｎｉｎｇ?ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ?（ｂ）??ｗｉｔｈ?ａ－ｇｌｙｃｏｓｙｌ?ｆｌｕｏｒｉｄｅ?ａｓ?ｇｌｙｃｏｓｙｌ?ｄｏｎｏｒ??糖苷合成酶存在合成产率高、时间短、有严格的立体选择性等优点，是合成寡糖的??有效途径之一。但其在合成几丁寡糖的应用上还面临较多的困难：①Ｐ－Ｎ－乙酰氨基葡萄??糖苷酶类型的糖苷合成酶有待开发。目前只有一例来自冻土毛霉的ＧＨ８５家族内切型??ＧｌｃＮＡｃａｓｅ的突变体Ｎ１７５Ｑ己见研究和报道［５５］，实现了水解活性的降低和转糖苷效率??的提升。②选择合适的非亲核氨基酸类型。根据己有的研究发现，用不同种类的非亲核??氨基酸来取代亲核体的突变体
【参考文献】：
期刊论文
[1]糖基转移酶合成相关糖苷类化合物研究进展[J]. 赵千婧,程瑶,王佳,孙新晓,申晓林,袁其朋. 北京化工大学学报(自然科学版). 2018(05)
[2]里氏木霉几丁质酶表达及其水解产物组成与结构分析[J]. 焦思明,程功,张毓宸,冯翠,任立世,李建军,杜昱光. 中国生物工程杂志. 2018(10)
[3]Solitalea canadensis源β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因克隆、异源表达和酶学特性[J]. 王梦,危双,王婷,Josef Voglmeir,刘丽. 微生物学报. 2017(08)
[4]β-N-乙酰氨基己糖苷酶及其合成寡糖的研究进展[J]. 陈晓迪,王凤山,肖敏. 微生物学报. 2017(08)
[5]β-葡萄糖苷酶合成龙胆二糖及产物分离[J]. 张林,王磊,吴广兴,勇强,余世袁. 林业工程学报. 2017(02)
[6]糖苷合成酶及应用的研究进展[J]. 孟岚,吴旭日,陈依军. 广西科学. 2017(01)
[7]右旋糖苷蔗糖酶的研究进展[J]. 韩瑨,吴正钧,徐晓芬,吴江. 食品研究与开发. 2016(02)
[8]维氏气单胞菌B565β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的表达、纯化及酶学性质[J]. 刘阳,杨雅麟,张宇婷,冉超,周志刚. 中国生物工程杂志. 2015(02)
[9]低聚半乳糖酶法合成条件的研究[J]. 陈真真,张涛,江波,缪铭,沐万孟. 食品与发酵工业. 2012(10)
[10]糖链的化学合成[J]. 王玥,叶新山. 生命科学. 2011(06)
硕士论文
[1]几丁寡糖联合顺铂对肺癌A549细胞及其移植瘤的影响[D]. 刘星.辽宁中医药大学 2017
[2]几种海洋寡糖免疫调控作用初探[D]. 刘美思.辽宁师范大学 2016
[3]家蚕几丁质酶与几丁质合成酶的基因表达与功能研究[D]. 孔令斐.苏州大学 2010
本文编号：3059812
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．３几丁质在真菌和昆虫中的合成途径??Ｆｉｇ?１．３?Ｔｈｅ?ｃｈｉｔｉｎ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐａｔｈｗａｙ?ｉｎ?ｆｕｎｇｉ?ａｎｄ?ｉｎｓｅｃｔｓ??（２）糖苷水解酶??
葡萄糖胺?ｅ°Ａ??图１．３几丁质在真菌和昆虫中的合成途径??Ｆｉｇ?１．３?Ｔｈｅ?ｃｈｉｔｉｎ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐａｔｈｗａｙ?ｉｎ?ｆｕｎｇｉ?ａｎｄ?ｉｎｓｅｃｔｓ??（２）糖苷水解酶??糖苷水解酶（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ?ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，ＧＨ）是一类催化水解糖链中特定糖苷键的糖苷??酶。ＣＡＺｙ数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ）根据蛋白质序列进化关系将其分为１００多个家??族。糖作水解酶根据催化机制的差别又可将其分为反转型糖苷水解酶（ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ?ｅｎｚｙｍｅｓ）??和保留型糖苷水解酶（ｒｅｔａｉｎｉｎｇ?ｅｎｚｙｍｅｓ），具体作用方式如图１．４所示。从保留型糖苷??７ｊＣ解酶的反应机制中我们知道除了水解活性，其还具有转糖甘（ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，?ＴＧ）??潜力：在保留型糖苷水解酶的反应中将形成糖基－酶中间体，若被另一糖分子攻击，则??发生转糖苷反应。转糖苷催化机制也可用于合成特定的低聚糖，目前已被应用于不少低??聚糖的生产中，例如，低聚果糖以蔗糖作为底物，利用（３－Ｄ－呋喃果糖苷酶可大量得到；??低聚半乳糖也可以乳糖为底物，用Ｐ－半乳糖苷酶催化合成；类似地，在右旋糖酐、低聚??异麦芽糖和环糊精等的酶法合成都得到了应用［４３￣４４］。类似的还有报道利用几丁质酶的转??糖苷活性来合成几丁寡糖。其中沙雷氏菌、米曲霉和烟曲霉等来源的ＧＨ１８家族几丁质??酶的转糖苷活性的研究报道较多
被利用于寡糖合成的反应中。糖苷合成酶一般利用氟代糖、硝基苯基糖苷作为糖基供体，??４－甲基伞形酮或硝基苯基修饰的糖苷做为受体。根据作用机制不同，糖苷合成酶也可分??为反转型和保留型两类（图１．５）。而且由于糖苷合成酶丧失水解活性，合成的寡糖产物??不会被再次水解，则可使产率得到提升。??产Ｏ?〇?Ｌ??．ＵＨ?（）丄０?０Ｍ?（＼?１，０?°??一?ａ?ｅｔ?Ｖ．１Ｉ?ｌ〇Ｈ?■??ｋ?（ｙＨ?ｆ?Ｙ?ｆ??Ｊｎｚ?ｌ?ｌ?Ｅｔ１ｓ２?Ｅｎｘ??（ｂ）?Ｅｎｚ??°＾°?｛〇Ｈ?ＨｆＡ〇??（丨Ｘ＾〇Ｒ??Ｆ?Ｖ〇ｆ?Ｉ??Ｅｎｚ?Ｅｎｚ??图１．５以ａ－氟代糖为糖基供体的反转型糖苷合成酶（ａ）和保留型糖苷合成酶（ｂ）的作用机制…Ｉ??Ｆｉｇ?１．５?Ｆ＾ｅａｃｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ?ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ?（ａ）?ａｎｄ?ｒｅｔａｉｎｉｎｇ?ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ?（ｂ）??ｗｉｔｈ?ａ－ｇｌｙｃｏｓｙｌ?ｆｌｕｏｒｉｄｅ?ａｓ?ｇｌｙｃｏｓｙｌ?ｄｏｎｏｒ??糖苷合成酶存在合成产率高、时间短、有严格的立体选择性等优点，是合成寡糖的??有效途径之一。但其在合成几丁寡糖的应用上还面临较多的困难：①Ｐ－Ｎ－乙酰氨基葡萄??糖苷酶类型的糖苷合成酶有待开发。目前只有一例来自冻土毛霉的ＧＨ８５家族内切型??ＧｌｃＮＡｃａｓｅ的突变体Ｎ１７５Ｑ己见研究和报道［５５］，实现了水解活性的降低和转糖苷效率??的提升。②选择合适的非亲核氨基酸类型。根据己有的研究发现，用不同种类的非亲核??氨基酸来取代亲核体的突变体
【参考文献】：
期刊论文
[1]糖基转移酶合成相关糖苷类化合物研究进展[J]. 赵千婧,程瑶,王佳,孙新晓,申晓林,袁其朋. 北京化工大学学报(自然科学版). 2018(05)
[2]里氏木霉几丁质酶表达及其水解产物组成与结构分析[J]. 焦思明,程功,张毓宸,冯翠,任立世,李建军,杜昱光. 中国生物工程杂志. 2018(10)
[3]Solitalea canadensis源β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因克隆、异源表达和酶学特性[J]. 王梦,危双,王婷,Josef Voglmeir,刘丽. 微生物学报. 2017(08)
[4]β-N-乙酰氨基己糖苷酶及其合成寡糖的研究进展[J]. 陈晓迪,王凤山,肖敏. 微生物学报. 2017(08)
[5]β-葡萄糖苷酶合成龙胆二糖及产物分离[J]. 张林,王磊,吴广兴,勇强,余世袁. 林业工程学报. 2017(02)
[6]糖苷合成酶及应用的研究进展[J]. 孟岚,吴旭日,陈依军. 广西科学. 2017(01)
[7]右旋糖苷蔗糖酶的研究进展[J]. 韩瑨,吴正钧,徐晓芬,吴江. 食品研究与开发. 2016(02)
[8]维氏气单胞菌B565β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的表达、纯化及酶学性质[J]. 刘阳,杨雅麟,张宇婷,冉超,周志刚. 中国生物工程杂志. 2015(02)
[9]低聚半乳糖酶法合成条件的研究[J]. 陈真真,张涛,江波,缪铭,沐万孟. 食品与发酵工业. 2012(10)
[10]糖链的化学合成[J]. 王玥,叶新山. 生命科学. 2011(06)
硕士论文
[1]几丁寡糖联合顺铂对肺癌A549细胞及其移植瘤的影响[D]. 刘星.辽宁中医药大学 2017
[2]几种海洋寡糖免疫调控作用初探[D]. 刘美思.辽宁师范大学 2016
[3]家蚕几丁质酶与几丁质合成酶的基因表达与功能研究[D]. 孔令斐.苏州大学 2010
本文编号：3059812
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3059812.html
最近更新
教材专著
