利用显微注射方法构建DGAT1过表达转基因小鼠

发布时间：2021-03-03 04:39

　　DGAT1酶（酰基辅酶A:二酰基甘氨酸-甘油酰基转移酶）利用酰基-CoA底物催化sn-1,2-二酰基甘油在sn-3位的酰化,是控制脂肪细胞中甘油三酯合成速率的关键酶。甘油三酯是肌内脂肪的主要成分,其含量的提高会促进肌间脂肪的沉积,因此DGAT1可以作为改良家畜肉质性状的备选基因。CRISPR/Cas9技术可以高效的实现基因的敲除或敲入。本研究构建了Rosa26位点定点整DGAT1基因的CRISPR/Cas9打靶载体,采用显微注射法将载体注入小鼠受精卵原核中,生产DGAT1过表达的转基因小鼠。研究结果如下:1.载体的构建本实验利用CRISPR/Cas9系统实现基因的定点敲入,首先构建了sgRNA/Cas9载体以及DGAT1同源重组载体,经过酶切、测序鉴定分析,证实两种载体构建成功。2.载体的功能验证利用电穿孔转染方法将sgRNA/Cas9载体、DGAT1同源重组载体转入C2C12细胞中,提取转染后的细胞基因组并利用PCR鉴定外源基因同源重组的情况,结果证明载体可以成功在预定位点敲入目的基因。3.转基因小鼠的制备与鉴定通过原核注射法将sgRNA/Cas9质粒、DGAT1整合载体共同注入小鼠... 

【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

CRSPR/Cas9质粒结构图

图 2.2 DGAT1-19T 双酶切鉴定电泳图M:200bpMarker 1：DGAT1-19T 载体Fig. 2.2 Identification of DGAT1-19T by double enzyme digestiM:200bpMarker 1:DGAT1-19T vector子的鉴定到小鼠 MCK 核心启动子，其片段大小为 1357bp，将该上，提取质粒进行酶切鉴定，鉴定结果与预期相符(图 100%，核心启动子获取成功。

图 2.3 MCK-19T 双酶切鉴定电泳图M:200bpMarker 1:MCK-19T 载体Fig. 2.3 Identification of MCK-19T by double enzyme digestiM:200bpMarker 1:MCK-19t vector鉴定到上游同源臂，得到预期为 996bp 大小的上游同源臂序入 pMD19-T 载体中，挑取菌液并提取质粒然后进行酶结果与正确序列进行比对，一致性达 100%，说明上游

【参考文献】：
期刊论文
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[4]陕北白绒山羊DGAT1基因外显子14多态性及其与部分生长*和胴体性状的关系[J]. 余刚,罗军,刘俊霞,韩雪峰,绳贺军,张丽娟,武会娟,曹艳红.  西北农林科技大学学报(自然科学版). 2008(05)

博士论文
[1]猪DGAT1基因肌肉超表达转基因小鼠及克隆猪的检测验证[D]. 黎婷.华中农业大学 2013



本文编号：3060620