应用CRISPR/Cas9和Cas9-D10A建立Nsun5基因敲除小鼠模型并分析脱靶效应

发布时间：2021-03-03 05:18

　　目的:为了检测CRISPR/Cas9系统的潜在脱靶效应,分别利用野生型Cas9和切口酶Cas9-D10A构建了RNA甲基转移酶Nsun5基因敲除小鼠模型,并对两种策略得到的F0小鼠进行脱靶分析,以比较两种敲除策略的特异性。方法:针对Nsun5基因第3外显子,设计1对sgRNA,将野生型Cas9 mRNA和切口酶Cas9-D10A mRNA分别同这对sgRNA混合后注入小鼠一细胞期受精卵中,实现靶基因敲除,比较两种Cas9得到的F0代敲除小鼠的脱靶效应。结果:利用CRISPR/Cas9和Cas9-D10A成功建立Nsun5基因敲除小鼠模型,对两种Cas9得到的F0代突变小鼠进行潜在脱靶位点分析,均未检测到脱靶位点的存在。结论:两种策略都成功构建了不含脱靶位点的Nsun5基因敲除小鼠模型,为进一步研究Nsun5的生物学功能打下基础。 

【文章来源】：南京医科大学学报(自然科学版). 2020,40(09)北大核心

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【部分图文】：

CRISPR/Cas9介导小鼠Nsun5基因敲除鉴定

本研究利用Cas9/sgRNA和Cas9-D10A/sgRNA对小鼠RNA甲基化相关基因Nsun5进行了敲除，检测了每个sgRNA潜在的脱靶位点，但并没有发现脱靶效应，为研究Nsun5的生物学功能提供了可靠的敲除小鼠模型。本研究挑选了10个最容易发生脱靶效应的位点进行检测，在其他未检测的位点，可能会存在脱靶效应；由于T7EN1酶切检测方法存在检测极限（小于1%的突变检测不到），低突变的脱靶位点可能会被遗漏；另外，首建小鼠易存在嵌合效应（DNA双链断裂发生在一细胞期之后），本研究只检测了脚趾基因组DNA的脱靶效应，不能代表其他器官，特别是生殖细胞中的脱靶情况。如利用全基因测序和靶向深度测序对首建鼠的后代进行测序，能更精确地检测这两种策略的脱靶效应。本课题组的前期研究显示，利用Cas9和双sgRNA敲除小鼠Ar基因时，在突变小鼠尾巴基因组中可以检测到1个脱靶位点[13]，但在Cas9-D10A和双sgRNA策略构建的小鼠中检测不到这个脱靶位点，说明脱靶的发生和序列特异性以及目标序列上下游的环境有一定关系。随着CRISPR/Cas9技术的不断完善，在科学研究和临床应用中发挥了举足轻重的作用。CRISPR/Cas9系统不仅可以对不同物种进行基因敲除[14-15]，还可以利用其造成的DNA双链断裂，同时提供供体DNA，在基因组中实现定点插入突变[16]。在基因调控上，利用催化区域失活的Cas9蛋白（dCas9，两个内切酶活性中心都被突变，失去切割活性，但是其在sgRNA的指导下仍能够和靶序列结合），成功对基因表达进行调控[17-18]。CRISPR/Cas9系统还可对染色体组蛋白进行修饰[19-20]，用于文库筛选[21-22]等。CRISPR-Cas工具极大地加快了研究进程，也为疾病诊断和治疗带来了新方法，值得进一步探索。

【参考文献】：
期刊论文
[1]m6A识别蛋白Ythdf3在精子发生中的作用研究[J]. 宋小玲,刘媛媛,王仿竹,沈彬.  南京医科大学学报(自然科学版). 2019(06)
[2]m6A识别蛋白Ythdf1在精子发生中的作用研究[J]. 刘媛媛,宋小玲,王仿竹,齐美杰,沈彬.  南京医科大学学报(自然科学版). 2019(02)



本文编号：3060687