丝瓜籽核糖体失活蛋白Luffin-α的基因克

发布时间：2021-03-04 18:53

　　[目的]克隆丝瓜籽Luffin-α基因,优化其在大肠杆菌中可溶性表达的条件,并进行初步的抗肿瘤活性测定。[方法]采用反转录PCR（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）的方法克隆获得丝瓜籽Luffin-α基因,构建p GEX6P-1/Luffin-α表达载体,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中获得重组菌株,摸索不同异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）浓度、诱导温度对重组蛋白可溶性表达的影响。以谷胱甘肽硫转移酶（glutathione-S-transferase,GST）亲和层析方法纯化目标蛋白,并使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和Western blot对其进行检测及鉴定。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（methylazo salt trace enzyme reaction colorimet... 

【文章来源】：浙江中医药大学学报. 2020,44(08)

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

RT-PCR扩增丝瓜籽Luffin-α基因

将上述克隆获得的Luffin-α基因通过酶切、连接方式克隆到pGEX6P-1载体的Bam HI和EcoRI位点处。将获得的重组质粒（pGEX6P-1/Luffin-α）进行双酶切鉴定，1%琼脂糖电泳检测结果显示，双酶切（Bam HI和Eco RI）产物出现一条大小约为800bp的条带，与目的条带大小一致。见图2。进一步测序验证后表明重组质粒构建成功。2.3 重组蛋白的初步表达鉴定

在诱导温度为16℃，IPTG终浓度分别为0.3、0.5、0.8、1mmol·L-1的条件下分别诱导20h。SDS-PAGE电泳图显示重组可溶性蛋白Luffin-α均有表达，但IPTG终浓度为0.8、1mmol·L-1的表达量比IPTG终浓度为0.3、0.5mmol·L-1的多，且由于IPTG终浓度为0.8和1mmol.L-1时表达量较为接近。见图4。因此，选用0.8mmol·L-1作为诱导Luffin-α基因可溶性表达的最佳IPTG浓度。图4 IPTG浓度对Luffin-α重组蛋白原核表达的影响

【参考文献】：
期刊论文
[1]EGFR配体生物学效应的多样性[J]. 谷少伟,米立志.  中国生物化学与分子生物学报. 2019(11)
[2]通过细胞穿膜肽和皂苷增强一种核糖体失活蛋白抗肿瘤活性[J]. 刘洋,曹雪玮,卢美雅,王富军,赵健.  生物技术通报. 2019(08)
[3]重组蛋白微生物表达系统的研究进展[J]. 黄浩,王阳,堵国成,康振.  生物产业技术. 2019(03)
[4]苦瓜MAP30蛋白研究现状及应用前景分析[J]. 刘子记,刘维侠,朱婕,牛玉,杨衍.  江苏农业科学. 2019(06)
[5]天花粉蛋白抗肿瘤作用及其机制的研究进展[J]. 李格,孙雨沛,黄益玲.  中成药. 2018(09)
[6]植物核糖体失活蛋白研究进展[J]. 黄梦琦,周娴,李婧姝,郭诗华,崔永红.  四川农业科技. 2018(08)
[7]核糖体失活蛋白及其在黄瓜中的表达分析（英文）[J]. 党刘毅,Pierre Rougé,Els JM Van Damme.  生物化学与生物物理进展. 2017(10)
[8]核糖体失活蛋白生物信息学分析[J]. 朱峰,冯建国,钱坤,袁树忠,杨益众.  扬州大学学报(农业与生命科学版). 2016(01)
[9]Luffin-β靶向融合免疫毒素的构建、表达及对非小细胞肺癌的抑制作用[J]. 项颖,李启英,王江红,王莉,黄德鸿,唐显军,张曼,张文军,杨涛,肖春燕.  肿瘤. 2013(04)
[10]丝瓜籽核糖体失活蛋白基因Luffin-a原核表达载体的构建[J]. 孙晓东,王燕,罗超,王珺,桑明.  中国医药导报. 2013(07)



本文编号：3063720