利用CRISPR/Cas9技术构建PLCγ1（S345F）基因点突变小鼠和Sik1基因敲除小鼠

发布时间：2021-03-05 03:45

　　目的:在对皮肤T细胞淋巴瘤（Cutaneous T cell lymphoma,CTCL）病人的研究中发现,有3个样本的基因组DNA在Plcg1（phospholipase C gamma 1,Plcg1）基因产生突变,其中2个样本在第11号外显子中具有冗余突变（c.1034T>C,p.S345F）,进而影响PLCγ蛋白催化结构域。为了探究该突变与CTCL发病的相关性,计划构建PLCγ1（S345F）基因点突变小鼠并初步分析其免疫细胞的变化情况,为进一步寻找CTCL发病的作用机制研究奠定基础。在生发中心B细胞对初始B细胞的基因表达差异分析中发现Sik1基因的高表达,但是具体作用尚未明确,构建Sik1基因敲除小鼠将促进Sik1基因在免疫系统中作用的研究。方法:CRISPR/Cas9基因编辑技术以其设计简单、效率高的优点在生物研究领域得到广泛应用。依据其原理我们在小鼠Plcg1基因和Sik1基因靶位点附近设计sgRNA,进行原核显微注射;测序确定小鼠基因型;流式细胞术分析PLCγ1（S345F）基因点突变小鼠和野生型小鼠的淋巴细胞及其亚群的变化。结果:PCR测序确定得到PLCγ1（S... 

【文章来源】：福建师范大学福建省

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【学位级别】：硕士

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PLCγ1(S345F)基因点突变小鼠模型设计方案

第一章敲除质粒的构建和功能验证-19-图1-1PLCγ1(S345F)基因点突变小鼠模型设计方案Fig.1-1DesignschemeofmousePLCγ1(S345F)genepointmutationmousemodel1.2.2Sik1-ko小鼠模型设计方法小鼠Sik1基因共有14个外显子，其翻译起始位点ATG在第2号外显子上，因此我们计划在第2号外显子上、起始密码子ATG之后设计sgRNA，通过显微注射技术将sgRNA和Cas9蛋白注射到小鼠受精卵中，以期构建Sik1基因敲除小鼠模型，并利用该模型对相关疾病的产生及其机制发生进行深入研究。根据CRISPR/Cas9基因编辑技术原理，Cas9蛋白会靶向切割DNA，形成双链缺口，通过非同源末端连接的DNA修复机制，从而造成Sik1基因的的阅读框发生改变，使Sik1基因失去原先的功能（图1-2）。图1-2Sik1-ko小鼠模型设计方案Fig.1-2Sik1-komousemodeldesign

福建师范大学庄依凡硕士学位论文-32-图1-3左侧Donor在基因组上的位置Fig.1-3LocationoftheleftDonoronthegenome图1-4右侧Donor在基因组上的位置Fig.1-4LocationoftherightDonoronthegenome1.2.7.2点突变Donor的功能验证通过PCR的方法合成Donor之后，为了进一步验证我们合成的Donor是否有效，我们将敲除质粒PX459-Plcg1-ki(C>T)-sg1（ki1）和Donor进行组合，然后转染L929细胞，利用嘌呤霉素来进行筛选，并使用有限稀释法获得单克隆细胞株。我们针对每一种组合挑取12个单克隆细胞株。获得细胞株以后我们提取这些细胞株的基因组DNA，对目标序列进行PCR扩增后将PCR产物送测序（引物与细胞株验证引物一致，见附表2），通过比对序列，最终确定该Donor是否有效。比对软件为Bioedit。1.3结果与分析1.3.1PLCγ1敲除重组质粒的鉴定1.3.1.1敲除重组质粒的鉴定经过上一章的sgRNA的合成、退火、与PX459线性载体连接、转化感受态细胞、菌液测序之后，我们比对测序结果序列（图1-5），表明Plcg1基因的敲除载体已经成功构建。


本文编号：3064518