TANK结合激酶1基因敲除PK15细胞系的构建

发布时间：2021-03-06 12:11

　　天然免疫是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线。TANK结合激酶1（TANK binding kinase 1,TBK1）是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键激酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1在伪狂犬病毒复制过程中的作用,本试验利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术构建了猪TBK1基因稳定敲除猪肾细胞系。首先针对TBK1基因外显子2区设计3条单链向导RNA（Single guide RNA,sgRNA）并在退火后将其连接到经Bsmb Ⅰ核酸内切酶切割过的载体质粒LentiCRISPR v2上得到重组质粒,然后将重组质粒和pMD2.G、psPAX2两种包装质粒共转染至人胚肾细胞HEK293T/17获取慢病毒并感染猪肾细胞（Porcine kidney 15,PK15）。用含嘌呤霉素（Puromycin）的培养基压力筛选获得TBK1基因敲除多克隆细胞系后提取细胞基因组,PCR扩增目的片段并将扩增产物退火,然后用T7核酸内切酶检测三条sgRNA的编辑效率。选取编辑效率最高的多克隆细胞系通过有限稀释法,获得TBK1基因敲除单克隆细胞... 

【文章来源】：河南农业大学河南省

【文章页数】：41 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
英文缩略表
摘要
1 文献综述
    1.1 天然免疫概述
    1.2 模式识别受体（PRRs）
        1.2.1 DNA识别受体
        1.2.2 RNA识别受体
        1.2.3 Toll样识别受体（TLRs）
    1.3 病原相关分子模式与损伤相关分子模式
        1.3.1 病原相关分子模式（PAMP）
        1.3.2 损伤相关分子模式（DAMP）
    1.4 IFN与IFN信号通路
        1.4.1 IFN简介及分类
        1.4.2     IFN的功能
        1.4.3 IFN信号通路
    1.5 TBK1与天然免疫
        1.5.1 TBK1结构与功能
        1.5.2 TBK1在天然免疫中的作用
    1.6 伪狂犬病
        1.6.1 伪狂犬病
        1.6.2 伪狂犬病毒
        1.6.3 PRV与天然免疫
    1.7 CRISPR/Cas9技术简介
        1.7.1 CRISPR/Cas9技术
        1.7.2 CRISPR/Cas9技术应用
        1.7.3 CRISPR/Cas9技术的优点与不足
    1.8 展望
2 引言
3 材料与方法
    3.1 材料
        3.1.1 细胞与病毒
        3.1.2 质粒及感受态
        3.1.3 试剂及耗材
    3.2 方法
        3.2.1 引物设计与合成
        3.2.2 sgRNA/Cas9表达载体的构建
        3.2.3 慢病毒包装及多克隆细胞系的构建
        3.2.4 T7核酸内切酶检测
-/-单克隆细胞系的构建">        3.2.5 PK15-TBK1^-/-单克隆细胞系的构建
        3.2.6 CCK-8细胞活力检测
        3.2.7 荧光观察及流式检测
        3.2.8 Real-time Quantitative PCR （RT-qPCR）
        3.2.9 Western blot检测PRV gB和PRV gE蛋白的表达
50)">        3.2.10 PRV子代病毒感染力测定(TCID₅₀)
        3.2.11 统计学分析
4 结果
    4.1 TBK1基因敲除细胞系的构建
    4.2 TBK1基因敲除对PK15细胞活力的影响
    4.3 TBK1基因敲除对PRV-GFP病毒复制的影响
    4.4 TBK1基因敲除对PRV gB、gE、TK基因转录的影响
    4.5 TBK1基因敲除对PRV gB和PRV gE蛋白表达的影响
    4.6 TBK1基因敲除对PRV子代病毒感染力的影响
    4.7 TBK1基因敲除对IL-1β、IFN-β及ISG15基因转录的影响
5 讨论与结论
    5.1 讨论
    5.2 结论
参考文献
Abstract


【参考文献】：
期刊论文
[1]干扰素抗病毒效力影响因素的研究进展[J]. 甘霖,赵俊,陈敬贤,王明丽.  微生物与感染. 2018(01)
[2]RIG-Ⅰ对Ⅰ型干扰素信号通路的调控[J]. 穆晓玲.  农业灾害研究. 2018(01)
[3]CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用研究进展[J]. 陈怡李,姚书忠.  国际生殖健康/计划生育杂志. 2017(06)
[4]CRISPR/Cas9技术在代谢性疾病研究中的应用进展[J]. 胡依萌,徐焱成.  山东医药. 2017(02)
[5]TANK结合激酶1在抗病毒免疫应答中的作用研究进展[J]. 王雪,张毓川,陈玮.  浙江大学学报(医学版). 2016 (05)
[6]病原相关分子模式和损伤相关分子模式在免疫炎症反应中的作用[J]. 丁烨,任静宜,于洪强,周延民,于维先.  国际口腔医学杂志. 2016(02)
[7]IKKε/TBK1信号通路调控与致癌作用的研究进展[J]. 唐人民,李俊明,邹秀兰.  中国老年学杂志. 2015(23)
[8]Toll样受体和其他分子识别受体在固有免疫中的相互作用[J]. 胥静,丁力,张俊平.  药学实践杂志. 2014(05)
[9]病原体相关分子模式与免疫识别受体研究进展[J]. 陶志云,施祖灏,朱春红,宋卫涛,宋迟,秦爱建.  中国免疫学杂志. 2014(05)
[10]仔猪伪狂犬病母源抗体消长规律的研究[J]. 孟庆利,徐利,石国魁,张硕.  养猪. 2014(01)

博士论文
[1]蛋白激酶Mst1调控抗病毒宿主防御的功能与机制研究[D]. 孟凡森.浙江大学 2017

硕士论文
[1]伪狂犬病毒gB蛋白单抗的制备及夹心ELISA检测PRV方法的建立[D]. 王方.吉林大学 2017
[2]巨噬细胞源性外泌体对脂肪细胞胰岛素敏感性的调节[D]. 郑雅文.苏州大学 2017
[3]伪狂犬病毒gB基因在毕赤酵母中的表达及初步应用[D]. 朱淑芬.山东农业大学 2012



本文编号：3067080