刺参免疫相关基因（AjFL-1和AjCystain）的克隆表达与功能分析
发布时间：2021-03-06 20:10
刺参（Apositichopus japonicus）属于棘皮动物门海参纲,是我国黄渤海地区重要的养殖品种之一。近年来,由于海洋环境的日益恶化,刺参极易受到细菌、病毒等病原微生物的感染,导致腐皮综合征、肿嘴病等疫病频发,给养殖业造成了巨大的经济损失,严重制约了刺参养殖业的健康发展。刺参缺乏适应性免疫系统,完全依赖固有免疫系统抵御病原侵染。因此,开展刺参固有免疫相关基因及其免疫功能的研究,对丰富和发展海洋无脊椎动物免疫学理论研究,保障刺参养殖产业的可持续发展意义重大。本研究利用分子生物学、生物信息学、免疫学等技术,以棘皮动物刺参（Apositichopus japonicus）为实验材料,开展了岩藻糖凝集素（AjFucolectin-1）和半胱氨酸蛋白酶抑制剂（AjCystain）基因的研究。克隆得到AjFL-1的开放阅读框（Open reading frame）,长度为546 bp,编码181个氨基酸,预测分子量为20 kDa。经BLAST序列比对,发现Aj FL-1与其他物种中的岩藻糖凝集素相似度在30%-40%之间。利用SMART进行结构域预测分析后发现AjFL-1由一个典型的岩藻...
【文章来源】：大连海洋大学辽宁省
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
AjFL-1的cDNA序列及翻译的氨基酸序列
图 3-2 刺参凝集素 AjFL-1 氨基酸的多序列比对注：黑色阴影被覆盖部分是氨基酸序列的相似度在 60％以上，保守性基序 h2DGx 用蓝色框标记，岩藻糖结合基序 HX26RXDX4[R/K]用红色框标记。Fig. 3-2 Multiple alignment of the CRD of AjFL-1 from A. japonicus (KY807069) with those of other F-typelectins including pentraxin from Xenopus tropicalis (P49263), fucolectin-like from Salmo salar(XP014056169.1), fucolectin-6-like isoformX2 from Branchiostoma belcheri (XP019622811.1), fucolectin-6from Larimichthys crocea (KKF09244.1), fucolectin-6 from Anguilla Anguilla (BAB03528.1), f-type lectinfrom Lateolabrax japonicus (ABI48893.1), furrowed from Drosophila melanogaster (NP511136.2), bindinfrom Crassostrea sikamea (ADD71693.1), and f-type lectin 1 from Pinctada fucata (AFO64339.2). The aminoacid sequences conserved with identity over 60% were shaded in dark, and the similar amino acids wereshaded in grey. The motif h2DGx was marked in blue box, and the fucose binding motif HX26RXDX4[R/K]was marked in red box.在进化树中，如图 3-3 所示，AjFL-1 首先与文昌鱼的岩藻糖凝集素 6 聚成一簇。其次
图 3-3 AjFL-1 氨基酸序列的进化树分析注：AjFL-1 用黑色三角形标出。Fig.3-3 Phylogenetic analysis of the AjFL-1 with fucolectins from other species.AjFL-1 was marked with▲. Sequences other than multiple sequence alignments also including fucolectin fromMorone Saxatilis (3CQOC).3.1.3 组织分布和灿烂弧菌刺激后的表达模式的变化检测 AjFL-1 的 mRNA 的组织特异性分布及其对病原菌刺激后的免疫响应，将帮助我们更好的揭示 F-型凝集素在刺参体内所发挥的免疫功能。在目前的研究中，使用 Cytb 作为内参，进行实时荧光定量 PCR 检测。如图 3-4 结果所示，AjFL-1 广泛表达于刺参的各个组织，但是存在组织特异性表达。其中体壁中表达量最高；其次为管足、呼吸树、体腔液和肠；纵肌和性腺中表达较微弱，这与之前的相关报道类似[31, 74, 75]。血细胞在无脊椎动物固有免疫反应中起关键作用，很多免疫相关基因在血细胞中高表达且发挥其功能。因为体腔液是刺参免疫防御的主要组织，所以我们进一步检测了经灿烂
【参考文献】：
期刊论文
[1]水生无脊椎动物血淋巴细胞分类及免疫研究进展[J]. 吴芳丽,王月,尚跃勇,严桂珍,孔辉,胡梦红,吕为群,王有基. 大连海洋大学学报. 2016(06)
[2]鱼类皮肤免疫应答及蛋白质组学[J]. 吕爱军,胡秀彩,孙敬锋,石洪玥,陈成勋,李莉,孔祥会. 水产科学. 2016(03)
[3]皮肤共生微生物:免疫系统第一道屏障[J]. 陈向东,王雪. 家庭医学(下半月). 2015(10)
[4]全球海参捕捞与养殖产量变动趋势研究[J]. 初建松,朱玉贵. 中国渔业经济. 2013(03)
[5]海参的免疫机制研究[J]. 王淑娴,叶海斌,于晓清,李天保,王勇强. 安徽农业科学. 2012(25)
[6]鳀鱼自溶水解过程的生化变化[J]. 徐伟,于刚,薛勇. 食品科技. 2010(04)
[7]海参为什么会排脏[J]. 邢坤. 齐鲁渔业. 2009(06)
[8]刺参夏眠的研究进展[J]. 袁秀堂,杨红生,陈慕雁,高菲. 海洋科学. 2007(08)
[9]海参防御机制的研究进展[J]. 孙永欣,王吉桥,汪婷婷,薛继鹏,刘钢,尤建嵩,徐永平. 水产科学. 2007(06)
[10]白血病患者造血细胞磷酸酶与半胱氨酸蛋白酶基因表达及其临床意义[J]. 韩颖,罗建民,贾晓辉,王福旭,姚丽,杜行严. 中华内科杂志. 2006(05)
博士论文
[1]中华绒螯蟹血细胞免疫效应因子的抗菌功能研究[D]. 竹攸汀.华东师范大学 2016
[2]松江鲈（Trachidermus fasciatus）几种凝集素的基因克隆与功能研究[D]. 于珊珊.山东大学 2013
[3]海参自溶过程中生化变化及抗氧化活性寡肽的研究[D]. 郑杰.江苏大学 2012
[4]栉孔扇贝关键模式识别受体介导的免疫应答机制研究[D]. 杨嘉龙.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2011
[5]养殖刺参免疫学特征与病害研究[D]. 李继业.中国海洋大学 2007
硕士论文
[1]内源酶在刺参肠自溶中的作用及寡肽抗氧化活性研究[D]. 段秀红.大连工业大学 2014
[2]刺参半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆、原核表达及其在自溶中的变化规律研究[D]. 张蕊.大连工业大学 2014
[3]杂色鲍组织蛋白酶L及其内源性抑制剂的研究[D]. 董训江.集美大学 2012
本文编号：3067735
【文章来源】：大连海洋大学辽宁省
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
AjFL-1的cDNA序列及翻译的氨基酸序列
图 3-2 刺参凝集素 AjFL-1 氨基酸的多序列比对注：黑色阴影被覆盖部分是氨基酸序列的相似度在 60％以上，保守性基序 h2DGx 用蓝色框标记，岩藻糖结合基序 HX26RXDX4[R/K]用红色框标记。Fig. 3-2 Multiple alignment of the CRD of AjFL-1 from A. japonicus (KY807069) with those of other F-typelectins including pentraxin from Xenopus tropicalis (P49263), fucolectin-like from Salmo salar(XP014056169.1), fucolectin-6-like isoformX2 from Branchiostoma belcheri (XP019622811.1), fucolectin-6from Larimichthys crocea (KKF09244.1), fucolectin-6 from Anguilla Anguilla (BAB03528.1), f-type lectinfrom Lateolabrax japonicus (ABI48893.1), furrowed from Drosophila melanogaster (NP511136.2), bindinfrom Crassostrea sikamea (ADD71693.1), and f-type lectin 1 from Pinctada fucata (AFO64339.2). The aminoacid sequences conserved with identity over 60% were shaded in dark, and the similar amino acids wereshaded in grey. The motif h2DGx was marked in blue box, and the fucose binding motif HX26RXDX4[R/K]was marked in red box.在进化树中，如图 3-3 所示，AjFL-1 首先与文昌鱼的岩藻糖凝集素 6 聚成一簇。其次
图 3-3 AjFL-1 氨基酸序列的进化树分析注：AjFL-1 用黑色三角形标出。Fig.3-3 Phylogenetic analysis of the AjFL-1 with fucolectins from other species.AjFL-1 was marked with▲. Sequences other than multiple sequence alignments also including fucolectin fromMorone Saxatilis (3CQOC).3.1.3 组织分布和灿烂弧菌刺激后的表达模式的变化检测 AjFL-1 的 mRNA 的组织特异性分布及其对病原菌刺激后的免疫响应，将帮助我们更好的揭示 F-型凝集素在刺参体内所发挥的免疫功能。在目前的研究中，使用 Cytb 作为内参，进行实时荧光定量 PCR 检测。如图 3-4 结果所示，AjFL-1 广泛表达于刺参的各个组织，但是存在组织特异性表达。其中体壁中表达量最高；其次为管足、呼吸树、体腔液和肠；纵肌和性腺中表达较微弱，这与之前的相关报道类似[31, 74, 75]。血细胞在无脊椎动物固有免疫反应中起关键作用，很多免疫相关基因在血细胞中高表达且发挥其功能。因为体腔液是刺参免疫防御的主要组织，所以我们进一步检测了经灿烂
【参考文献】：
期刊论文
[1]水生无脊椎动物血淋巴细胞分类及免疫研究进展[J]. 吴芳丽,王月,尚跃勇,严桂珍,孔辉,胡梦红,吕为群,王有基. 大连海洋大学学报. 2016(06)
[2]鱼类皮肤免疫应答及蛋白质组学[J]. 吕爱军,胡秀彩,孙敬锋,石洪玥,陈成勋,李莉,孔祥会. 水产科学. 2016(03)
[3]皮肤共生微生物:免疫系统第一道屏障[J]. 陈向东,王雪. 家庭医学(下半月). 2015(10)
[4]全球海参捕捞与养殖产量变动趋势研究[J]. 初建松,朱玉贵. 中国渔业经济. 2013(03)
[5]海参的免疫机制研究[J]. 王淑娴,叶海斌,于晓清,李天保,王勇强. 安徽农业科学. 2012(25)
[6]鳀鱼自溶水解过程的生化变化[J]. 徐伟,于刚,薛勇. 食品科技. 2010(04)
[7]海参为什么会排脏[J]. 邢坤. 齐鲁渔业. 2009(06)
[8]刺参夏眠的研究进展[J]. 袁秀堂,杨红生,陈慕雁,高菲. 海洋科学. 2007(08)
[9]海参防御机制的研究进展[J]. 孙永欣,王吉桥,汪婷婷,薛继鹏,刘钢,尤建嵩,徐永平. 水产科学. 2007(06)
[10]白血病患者造血细胞磷酸酶与半胱氨酸蛋白酶基因表达及其临床意义[J]. 韩颖,罗建民,贾晓辉,王福旭,姚丽,杜行严. 中华内科杂志. 2006(05)
博士论文
[1]中华绒螯蟹血细胞免疫效应因子的抗菌功能研究[D]. 竹攸汀.华东师范大学 2016
[2]松江鲈（Trachidermus fasciatus）几种凝集素的基因克隆与功能研究[D]. 于珊珊.山东大学 2013
[3]海参自溶过程中生化变化及抗氧化活性寡肽的研究[D]. 郑杰.江苏大学 2012
[4]栉孔扇贝关键模式识别受体介导的免疫应答机制研究[D]. 杨嘉龙.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2011
[5]养殖刺参免疫学特征与病害研究[D]. 李继业.中国海洋大学 2007
硕士论文
[1]内源酶在刺参肠自溶中的作用及寡肽抗氧化活性研究[D]. 段秀红.大连工业大学 2014
[2]刺参半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆、原核表达及其在自溶中的变化规律研究[D]. 张蕊.大连工业大学 2014
[3]杂色鲍组织蛋白酶L及其内源性抑制剂的研究[D]. 董训江.集美大学 2012
本文编号：3067735
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